КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-14-20046
НазваниеПерепрограммирование клеток жировой ткани с использованием аденоассоциированных вирусных векторов
РуководительЕгоров Александр Дмитриевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический Университет "СИРИУС", Краснодарский край
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс).
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Ключевые словаБорьба с ожирением, Побурение адипоцитов, Клеточное репрограммирование, Транскрипционная регуляция, Аденоассоциированные вирусы
Код ГРНТИ34.25.37
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности в развитых и развивающихся странах, в том числе в России. Метаболические нарушения, такие как ожирение и сахарный диабет 2-го типа, значительно увеличивают риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, что определяет интерес исследовательских групп к этой тематике.
Ожирение диагностируется более чем у полумиллиарда людей и, являясь предвестником сахарного диабета 2-го типа, напрямую влияет на преждевременную смертность в этой группе.
По данным Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи, Краснодарский край – один из регионов с наибольшей долей жителей с ожирением (27%), наряду с Калужской (33% жителей), Московской (30%) и Нижегородской (28%) областями, а также Алтайским краем (27%). Кроме того, согласно последним статистическим данным, в Краснодарском крае зарегистрировано наибольшее количество случаев ожирения у детей и подростков в возрасте от 0 до 15 лет (14637).
Развитие жировой ткани происходит как в ходе эмбрионального развития, так и на протяжении всей жизни организма. При этом, в процессе адипогенеза из мезенхимальных стволовых клеток образуются адипоциты. Морфологически и функционально различают белый и бурый типы жировой ткани. Основную массу этих двух типов жировой ткани составляют, соответственно, клетки: белые и бурые адипоциты.
Бурая жировая ткань в организме взрослого человека представлена мало и сосредоточена в подмышечных впадинах, межлопаточной и надключичной областях. В бурых адипоцитах экспрессируется ген термогенина UCP1, белка разобщающего дыхательную цепь в митохондриях, что позволяет транспортируемым протонам входить в матрикс без синтеза АТФ. Это приводит к высвобождению энергии в форме тепла, а поскольку вместе с протоном UCP1 переносит свободные жирные кислоты, использующиеся в качестве субстрата для окисления в бурой жировой ткани, то и к ускорению катаболического обмена. Показано, что среди людей с бурой жировой тканью меньше распространены кардиометаболические заболевания. Наличие бурой жировой ткани коррелирует с более низким уровнем диабета 2-го типа, дислипидемии, ишемической болезни сердца, гипертонии.
Хорошо описаны транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов: к ним относятся PGC1α (коактиватор основного фактора транскрипции адипогенеза PPARγ), N-метилтрансфераза лизинов гистонов PRDM16 и совсем недавно охарактеризованный фактор FoxP4. Активация программы бурового адипогенеза в белой жировой ткани приводит к появлению скоплений «бежевых» адипоцитов, в которых происходит интенсивный липолиз и термогенез.
Терминальная дифференцировка клеток белой жировой ткани была предметом наших предыдущих исследований. Были получены результаты, описывающие не исследованные ранее аспекты адипогенеза, такие как вовлеченность транскрипционных факторов TALE в раннюю активацию генов дифференцировки адипоцитов, а также чувствительность клеток-предшественников к гормонам.
В данном проекте предполагается использовать генетические конструкции, кодирующие транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4, для активации транскрипционной программы бурой жировой ткани, трансдиффенцировки белого в бежевый жир. Доставка генов, кодирующих регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов, будет осуществляться при помощи аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов, которые демонстрируют высокую специфичность по отношению к клеткам жировой ткани. Кроме того, для ограничения неспецифических эффектов мы планируем использовать тканеспецифичные промоторы для ограничения экспрессии трансгенов, а также возможно регулировать активность с помощью оптогенетического модуля.
На первом этапе планируется создание генетических конструкций для последующей сборки в аденоассоциированные вирусные частицы.
Последующее тестирование плазмид, кодирующих транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 будет проводиться на линии преадипоцитов мыши 3T3-L1. Клетки этой линии способны к спонтанной дифференцировке, а при экспрессии генов транскрипционных факторов мы рассчитываем регистрировать экспрессию термогенина (UCP1).
На предварительно дифференцированных клетках линии 3T3-L1 возможно протестировать генетические конструкции, кодирующие транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 под контролем тканеспецифичных промоторов. После проверки способности генетических конструкций, кодирующих транскрипционные регуляторы дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 под контролем тканеспецифичных промоторов, к стимуляции экспрессии UCP1 планируется продукция аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов.
Для оценки трансдуцирующей способности аденоассоциированных вирусных векторов и стимуляции экспрессии UCP1 планируется использовать как клетки линии 3T3-L1, так и животных (мыши линии C57/Bl6 на нормальной и высокожировой диете). В распоряжении научного коллектива есть всё необходимое оборудование, включая тепловизор FLIR T840, который позволяет регистрировать тепловое излучение.
Ожидаемые результаты
Планируемое исследование имеет своей целью разработать инновационный терапевтический подход для лечения ожирения и связанных с ним метаболических нарушений.
В результате выполнения данного проекта будут получены следующие результаты:
1. Исследовано влияние экспрессии транскрипционных регуляторов дифференцировки бурых адипоцитов PRDM16 и FoxP4 на индукцию дифференцировки преадипоцитов 3T3-L1. В качестве одного из ключевых параметров будет изучено изменение экспрессии генов при доставке генов транскрипционных факторов, в частности будет определяться относительная экспрессия UCP1.
2. Изучена способность генетических конструкций, кодирующих гены транскрипционных регуляторов дифференцировки бурых адипоцитов, влиять на экспрессию генов предварительно дифференцированных клеток линии 3T3-L1.
3. Протестированы тканеспецифичные промоторы для ограничения экспрессии генов транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4.
4. Изучена возможность разделения (split) генов транскрипционных факторов PRDM16 и FoxP4 для оптогенетического контроля над транскрипционной активностью.
5. Сборка аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов для тканеспецифичной доставки генов транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4 в клетки белой жировой ткани.
6. Определена эффективность доставки генов транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4 с использованием аденоассоциированных вирусных векторов в клетки белой жировой ткани in vivo на животной модели (мыши линии C57/Bl6 на нормальной и высокожировой диете). Для функциональных тестов in vivo будет использоваться тепловизионная техника, позволяющая регистрировать тепловое излучение.
Таким образом, выполнение данного проекта позволит применить ранее не исследованные способы для трансдифференцировки белых адипоцитов в бежевые. Практическая значимость данного исследования определяется возможностью прямого использования разработанных аденоассоциированных вирусных препаратов в качестве лекарственного средства для лечения ожирения и других метаболических заболеваний.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения первого этапа данного проекта были разработаны системы амплификации и детекции экспрессии генов FOXP4, PRDM16, UCP1. С использованием разработанных систем были амплифицированы участки геноа PRDM16 и кодирующая последовательность гена FOXP4. В результате амплификации в образцах РНК бурой жировой ткани и тотальной РНК мозга был обнаружен целевой фрагмент гена UCP1.
Для экспериментов по трансфекции и вирусной трансдукции кодирующая последовательность гена FOXP4 была заклонирована в вектор pAAC-CMV-MCS. Последовательность заклонированной вставки подтверждена секвенированием. Использование данной плазмиды позволяет получить аденоассоциированный вектор для вирусной доставки гена FOXP4 in vivo.
В результате трансфекции преадипоцитов и дифференцированных адипоцитов линии 3T3-L1 плазмидой pAAC-CMV-FOXP4 наблюдались фенотипические изменения после дифференцировки: более выраженным был характерный для клеток бежевой жировой ткани многокапельный фенотип.
Масс-спектрометрическое исследование экстрагированных липидов показало значимые различия в липидном составе, причём для разных групп: нейтральных липидов, фосфо- и сфинголипидов. Подобные изменения свидетельствуют о характерном влиянии FOXP4 на транскрипционные сети адипогенеза и активацию генов, характерных для клеток бурой жировой ткани.
В связи с этим нами планируется подробное изучение способности генетических конструкций, кодирующих гены транскрипционных регуляторов дифференцировки бурых адипоцитов (FOXP4 и PRDM16), влиять на экспрессию генов предварительно дифференцированных клеток линии 3T3-L1.
Ход работ по выполнению первого этапа данного проекта был представлен на Всероссийской конференции "Синтетеическая биология и биофармацевтика" (г. Новосибирск), на VII Съезде биохимиков и молекулярных биологов России (г. Сочи), международном проекте популяризации науки Science Slam (пгт Сириус). Также данный проект освещался в федеральных СМИ и местных информационных агенствах (более 15 различных источников, включая ТАСС, https://nauka.tass.ru/nauka/14166759;
Российскую газету, https://rg.ru/2022/03/24/reg-ufo/v-siriuse-nachali-rabotu-nad-preparatom-dlia-lecheniia-ozhireniia.html; канал «Россия» ВГТРК https://vesti-sochi.tv/obshhestvo/74401-uchenye-siriusa-pristupili-k-razrabotke-preparata-dlya-borby-s-ozhireniem). О нашем проекте также упоминали научно-популярные проекты (Научно-популярный журнал "Машины и механизмы", http://21mm.ru/news/nauka/uchenye-v-rossiyskom-universitete-sirius-nachali-rabotu-nad-genoterapevticheskim-preparatom-dlya-lech/; "Биомолекула").
Публикации
1. Малоголовкин А.С., Егоров А.Д., Карабельский А.В., Иванов Р.А., Верхуша В.В. Optogenetic technologies in translational cancer research Biotechnology Advances, Volume 60, November 2022, 108005 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2022.108005
2. Егоров А.Д. Аденоассоциированные вирусные векторы для доставки генов в клетки жировой ткани Синтетическая биология и биофармацевтика. Материалы всероссийской конференции, стр. 85, Новосибирск, 2022, Издательство: ООО «Офсет-ТМ» (год публикации - 2022)
3. - В "Сириусе" начали работу над препаратом для лечения ожирения Российская газета, - (год публикации - )
4. - В "Сириусе" приступили к разработке препарата для борьбы с ожирением ТАСС, - (год публикации - )
5. - Ученые «Сириуса» приступили к разработке препарата для борьбы с ожирением Кубанские новости, - (год публикации - )
6. - Ученые университета «Сириус» приступили к разработке препарата для борьбы с ожирением НОВОСТИ ФТ «СИРИУС», - (год публикации - )
7. - Ученые «Сириуса» приступили к разработке препарата для борьбы с ожирением Государственный интернет-канал «Россия», Всероссийская государственная телевизионная и радиовещательная компания, - (год публикации - )
8. - Ученые в российском университете «Сириус» начали работу над генотерапевтическим препаратом для лечения ожирения Научно-популярный журнал "Машины и механизмы", - (год публикации - )
9. - Российские ученые работают над препаратом для борьбы с ожирением KazanFirst, - (год публикации - )
10. - В «Сириусе» создадут препарат для борьбы с ожирением Городской интернет портал SOCHI.COM, - (год публикации - )
11. - ДЛЯ БОРЬБЫ С ОЖИРЕНИЕМ СМИ «Звезда Сочи», - (год публикации - )
12. - Российские ученые разрабатывают препарат для борьбы с ожирением Еженедельная газета "Столица С", - (год публикации - )
13. - В «Сириусе» разработают лекарство от ожирения Народная газета Сочи, - (год публикации - )
14. - В "Сириусе" приступили к разработке препарата для борьбы с ожирением Проект "История медицины" МГМСУ им. А.И. Евдокимова, - (год публикации - )
15. - Ученые создают препарат для лечения пациентов с ожирением Сетевое издание «Анонсенс», - (год публикации - )
16. - Сириус — двойная звезда науки: Биотехнология и Генная терапия Научно-популярный портал «Биомолекула», - (год публикации - )
17. - В "Сириусе" начали работу над препаратом для лечения ожирения Об этом сообщает "Рамблер". Далее: https://news.rambler.ru/science/48357533/?utm_content=news_media&utm_medium=read_more&utm_source=copylink Рамблер/новости, - (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. а) В рамках изучения способности генетических конструкций, кодирующих гены транскрипционных регуляторов дифференцировки бурых адипоцитов FOXP4 и PRDM16, влиять на экспрессию генов предварительно дифференцированных клеток линии 3T3-L1 были выявлены значимые изменения в уровне относительной экспрессии для генов Elovl3, Elovl6 – элонгаз жирных кислот (регуляция метаболизма жирных кислот), Srebf1 - фактор транскрипции, связывающий регуляторные элементы стеролов - 1с, ChREBP - фактор транскрипции, связывающий регуляторные элементы углеводов. Также были подтверждены данные о значимом изменении уровня экспрессии PRDM16-зависимых генов Ucp1, Cidea и Dio2.
б) Для детекции экспрессии гена UCP1 в различных тканях организма мыши (Mus musculus), а также для изучения активации экспрессии гена UCP1 были созданы репортерные конструкции pAAV-UCP1-Kat2s и pAAV-UCP1enhanced-Kat2s, кодирующие флуоресцентный белок Katushka2S под контролем промотора UCP1 и, соответственно, содержащего энхансер гибридного промотора UCP1.
в) Были закуплены реактивы для создания библиотек РНК для секвенирования на системе Illumina, а также подготовлены лизаты из дифференцированных клеток 3T3-L1 для изучения воздействия на транскриптом экспрессионных кассет, кодирующих FOXP4 и PRDM16.
2. Создание репортерной конструкции UCP1-mKat2.
а) Было проведено клонирование тканеспецифичных промоторов и получены экспрессионные конструкции типа pAAV-(promoter)-MCS для ограничения экспрессии генов транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4. Были получены и отсеквенированы гибридные промотрные последовательности генов UCP1 и AdipoQ.
б) Для изучения активации экспрессии гена UCP1 были созданы репортерные конструкции pAAV-UCP1-Kat2s и pAAV-UCP1enhanced-Kat2s, были собраны аденоассоциированные вирусные вектора для системного введения экспериментальным животным (Mus musculus). Функциональность данных промоторов была подтверждена in vivo.
3. Была изучена возможность разделения (split) генов транскрипционных факторов PRDM16 и FoxP4 для оптогенетического контроля над транскрипционной активностью. Былоа проведено клонирование гена димеризующегося бактериального фитохрома iLight, таким образом было осуществлено разделение (split) областей генов транскрипционных факторов PRDM16 и FoxP4, кодирующих различные функциональные домены, для применения оптогенетического контроля над транскрипционной активностью. Разделение генов на части, раздельно кодирующие N-концевую и C-концевую части белков PRDM16 и FoxP4, соответственно, с одной стороны позволит ограничит функциональность этих генов (и уменьшить побочные эффекты от сверхэкспрессии), а с другой стороны даст возможность для точной настройки (fine-tuning) и контроля экспрессии зависимых генов.
4. Нами была произведена продукция аденоассоциированных вирусных векторов 8 и 9 серотипов, кодирующих гены транскрипционных регуляторов PRDM16 и FoxP4. Было проведено пилотное исследование, в котором аденоассоциированные вирусные векторы вводились локально в области жировых отложений мышей линии C57/Bl6, для обеспечения специфичной доставки в клетки белой жировой ткани.
5. Изучена способность вирусных векторов, кодирующих гены транскрипционных регуляторов дифференцировки бурых адипоцитов FOXP4 и PRDM16, влиять на экспрессию генов предварительно дифференцированных клеток линии 3T3-L1. Нами были изучены изменения в экспрессии генов факторов транскрипции, задействованных в адипогенезе: относительный уровень экспрессии генов PPARα и C/EBPα повышается в образцах клеток, трансдуцированных AAV8-FOXP4. Характерной особенностью бежевых и бурых адипоцитов является снижение уровня липогенеза: нами было показано, что после трансдукции AAV8-PRDM16 и AAV8-FOXP4 происходит значительное снижение экспрессии генов элонгаз жирных кислот Elovl3 и Elovl6, а также гена Srebf1, кодирующего регулирующий обмен липидов транскрипционный фактор.
6. Масс-спектрометрическое исследование состава липидов показало, что трансдукция дифференцированных клеток 3T3-L1 аденоассоциированным вирусом 8-го серотипа, кодирующим ген PRDM16, приводит к значительному снижению содержания ненасыщенных жирных кислот (С14:1, С16:1, С18:1, C20:1, С20:4, С22:6) по сравнению с контролем. Содержание 17 липидов (большая часть относится к классу глицерофосфолипидов) оказалось достоверно выше по сравнению с контролем. При трансдукции дифференцированных клеток 3T3-L1 аденоассоциированным вирусом 8-го серотипа, кодирующим ген FOXP4 выявлены статистически значимые изменения уровней для 15 липидов по сравнению с контролем. При трансдукции дифференцированных клеток 3T3-L1 аденоассоциированным вирусом 8-го серотипа, кодирующим ген фоллистатина наблюдается достоверное снижение содержания арахидоновой кислоты (С20:4). Изменения в составе липидов подтверждают обнаруженные ранее изменения в экспрессии генов.
7. Нами были определены кандидатные сайты для разделения (split) генов транскрипционных факторов PRDM16 и FoxP4, которые потом были использованы для сборки целевых генетических конструкций на для последующего применения оптогенетического контроля. Для создания разделённых (split) конструкций был использован модифицированный однокомпонентный бактериальный фитохром iLight.
8. Исследование биораспределения аденоассоциированных вирусных векторов 2,8 и 9 серотипа в жировой ткани показало наличие флуоресценции в ткани после введения векторов 8 и 9 серотипа.
9. Исследование распределения флуоресценции методом метаболического имиджинга в адипоцитах. Для оценки активности метаболического кофермента НАД(Ф)Н по результатам обработки FLIM-микроскопии, были рассчитаны следующие параметры жизни автофлуоресценции НАД(Ф)Н: τm – среднее время жизни, τ1 – время жизни свободной формы, τ2 – время жизни связанной формы. Количественные параметры вычисленного среднего времени жизни НАД(Ф)Н между контролем (NTC) и образцами, трансдуцированными PRDM16 (AAV8_PRDM16) и FOXP4 (AAV8_FOXP4) отличались. Наиболее выраженным изменением после трансдукции AAV8_PRDM16 и AAV8_FOXP4 было уменьшение времени жизни свободной формы НАД(Ф)Н.
Данные, полученные в отчетном периоде работ по проекту были представлены на международном конгрессе “CRISPR-2023” (гор. Новосибирск, 11-13 сентября 2023 года), Курчатовском геномном форуме (КурчатовГенТех - 2023, гор. Москва, 17-20 октября 2023 года), 9-ой Международной конференции по медицинской химии (9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, 1–30 November 2023), Конференции Cell Press Beijing Cellular and gene therapy (гор. Пекин, 7 December 2023), Азиатской выставке инноваций и изобретений в Гонконге (Asia Exhibition of Innovations and Inventions Hong Kong, 7-8 December 2023, Золотая медаль выставки за изобретение).
Полученные результаты послужили основой для патентной заявки № 2023127016/10(059839). Дата подачи заявки 21/10/2023. Решение о выдаче патента 04/12/2023.
Подано 4 публикации: Влияние пищевых молекул на переход белой жировой ткани в бежевую Ожирение и метаболизм (2023 г.), Viral vectors in gene replacement therapy Biochemistry (Moscow) (2023 г.), Аденоассоциированные вирусные векторы для перепрограммирования жировых клеток Гены и клетки (2023 г.), Assessment of 3T3-L1 transduction using different AAV capsid variants 9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry (2023 г.).
Проводящемуся исследованию посвящены 39 публикаций в средствах массовой информации, в том числе: ТАСС (В России создали препарат для лечения наследственного ожирения, https://nauka.tass.ru/nauka/19130095), Мир 24 (Какие исследования проводятся учеными в университете «Сириус»?, https://mir24.tv/news/16541065/kakie-issledovaniya-provodyatsya-uchenymi-v-universitete-sirius), «Комсомольская правда» (Жир - проблема или суперсила?, https://www.kp.ru/putevoditel/spetsproekty/stand-up/alexander-egorov/ https://radiokp.ru/podcast/nauchnyy-stendap/693451).
Публикации
1. Егорова В.С., Гурциева Д.Т., Егоров А.Д. Влияние пищевых молекул на переход белой жировой ткани в бежевую Ожирение и метаболизм, - (год публикации - 2023)
2. Минская Е.С, Галиева А.А., Егоров А.Д., Иванов Р.А., Карабельский А.В. Viral vectors in gene replacement therapy Biochemistry (Moscow), - (год публикации - 2023)
3. Бойченко С.С., Гасанов Н.Б., Егоров А.Д. Assessment of 3T3-L1 transduction using different AAV capsid variants 9th International Electronic Conference on Medicinal Chemistry, S5. Natural Products and Biopharmaceuticals (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ECMC2023-15628
4. Бойченко С.С., Юнин М.А., Егоров А.Д. Аденоассоциированные вирусные векторы для перепрограммирования жировых клеток Гены и клетки, Том XVIII, Приложение, стр. 8 (год публикации - 2023)
5. Егоров Александр Дмитриевич, Бойченко Станислав Сергеевич Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего -, 2023127016 (год публикации - )
6. - В России создали препарат для лечения наследственного ожирения ТАСС, - (год публикации - )
7. - В России создали препарат для лечения наследственного ожирения РНФ, - (год публикации - )
8. - Какие исследования проводятся учеными в университете «Сириус»? МИР 24, - (год публикации - )
9. - Жир - проблема или суперсила? Комсомольская правда, - (год публикации - )
10. - Жир - проблема или суперсила? радио Комсомольская правда, - (год публикации - )
11. - Какие исследования проводятся учеными в университете «Сириус» Интернет-портал СНГ, - (год публикации - )
12. - Новый российский препарат перепрограммирует жировые клетки для снижения веса ФАРММЕДПРОМ, - (год публикации - )
13. - Специалисты центра «Сириус» создали препарат для лечения ожирения МедЗдравИнфо, - (год публикации - )
14. - В России разработали препарат для людей с наследственными формами ожирения ТехноНовости, - (год публикации - )
15. - Специалисты центра «Сириус» создали препарат для лечения ожирения Дзен. Новости, - (год публикации - )