КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-14-00013

НазваниеНеравномерность эволюционно-эпидемической траектории парадоксального древнего субтипа Восточно-Азиатской линии Mycobacterium tuberculosis: стохастические флуктуации или каузативные корреляции?

РуководительМокроусов Игорь Владиславович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2023 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (35).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаMycobacterium tuberculosis, туберкулез, лекарственная устойчивость, вирулентность, молекулярная эволюция, молекулярная эпидемиология, филогегорафия, полногеномное секвенирование, миграции населения, история человечества

Код ГРНТИ34.27.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект является мультидисциплинарным, на пересечении популяционной и системной биологии, геномной биоинформатики, фундаментальной и персонализированной медицины. Взаимоотношения Mycobacterium tuberculosis и Homo sapiens непредсказуемы, драматичны и многогранны. Несмотря на усилия по борьбе с туберкулезом (ТБ), известные эпидемические и мультирезистентные штаммы продолжают циркулировать и демонстрируют свою повышенную адаптивность, остаются высокотрансмиссивными и эволюционируют в сторону развития широкой лекарственной устойчивости. Кроме того, в рамках недооцененных и малоизученных сублиний возбудителя могут возникать совершенно новые устойчивые и/или трансмиссивные клональные кластеры. Предметом продолженного исследования будут необычные клональные кластеры актуального микроорганизма Mycobacterium tuberculosis с парадоксальным сочетанием эволюционных, эпидемиологических и филогеографических особенностей: входящие в Восточно-Азиатскую филогенетическую линию (генотип Beijing), эндемичные для Японии и Кореи, до последнего времени они были незначительно распространены в большинстве регионов России, тем не менее наблюдается нарастание их циркуляции в западной Сибири и Дальнем Востоке. При этом все штаммы этих кластеров независимо от региона происхождения, отличаются сильной ассоциацией с лекарственной устойчивостью, причем не только множественной, но и широкой. Направленное на конкретные геноварианты в рамках генетического семейства Beijing M. tuberculosis, исследование поможет приблизиться к пониманию более общих единых предпосылок возникновения эмерджентных резистентных кластеров, движущих сил их распространения в мире, в особенности в уязвимых популяциях и группах риска. Это станет базой для лучшего понимания других подобных патогенов и развития превентивных мер как для диагностики, так и для эпидемиологии и выбора адекватного лечения. АКТУАЛЬНОСТЬ исследования определяется контекстом глобализации и опасности широкого распространения таких высокорезистентных штаммов M. tuberculosis, в т.ч и с крупными потоками мигрантов. Это же определяет и социально-экономический аспект т.е. проблему потерь мировой экономики. Объектом исследования являются высокорезистентные геноварианты M. tuberculosis Beijing 14717-15 и Beijing 1071-32. В частности, обнаруженная нами гипервирулентность и гиперлетальность одного их них (Beijing 14717-15), как и мутации в ряде генов адаптации и вирулентности «усугубляют» и конкретизируют актуальность. Один из наших общих выводов по проекту 2019 – важность изучения компактных кластеров как наиболее значимых действующих лиц эпидемического процесса. Это вовсе не очевидные выводы, принимая во внимание, что предметом многих исследований являются произвольно взятые и необязательно репрезентативные штамму из гетерогенных филогенетических ветвей. При этом омиксные технологии, запланированные в Проекте 2022, важны не только для теоретической биологии, но и для применения в персонализированной медицине, в том числе и для лечения больных зараженных конкретными штаммами, не только лекарственно-устойчивыми, но и гипервирулентными. Повышенная опасность последних была показана нами в завершенном проекте, как в модели животных, так и применительно к человеческой популяции. Гипербола неизвестного журналиста, определившего открытый нами в Бурятии штамм как «наиболее смертоносный» (и далее повторенная другими СМИ) при всей ее чрезмерности, вполне адекватна. С другой стороны, понимание особенностей возникновения другого штамма-кластера, имеющего относительно широкое распространение на юге Западной Сибири и определяемого нами как «омский», представляет существенный интерес для приближения к информированному прогнозированию текущих динамических изменений популяции возбудителя туберкулеза. Реконструкция прошедших событий, в том числе условий и времени возникновения омского кластера позволит лучше предсказать риски подобных событий в будущем и, возможно, если не избежать, то уменьшить их вероятность. Изучение экспрессии сигнальных молекул в органах и тканях в норме и при различной патологии является перспективным и многообещающим направлением для разработки эффективных методов прижизненной диагностики и лечения социально-значимых заболеваний. Крайне актуально исследовать динамику в легочной ткани молекулярных маркеров воспаления и функциональной адаптации клетки при развитии патологического процесса, чтобы верифицировать и оценить маркеры, позволяющие прогнозировать развитие и различную степень тяжести туберкулёза. При этом, планируя такое новое исследование в рамках пролонгированного гранта, мы ожидаем увидеть различия штаммов, относящихся к различным генетическим кластерам, которые составляют объект данного проекта. Их различия более чем возможны и в отношении дифференциальной экспрессии определенных генов и в составе протеома, что мы показали при геномном и функциональном анализе в рамках завершенного проекта при in silico анализе полногеномных данных и планируем выяснить экспериментальными методами в Проекте 2022. Во время реализации проекта 2019 были получены новые комплексные результаты мирового уровня, сделаны общие выводы частично меняющие взгляд на существующие теории о эволюции и адаптации, под влиянием разнонаправленного воздействия разных факторов. Естественное продолжение проекта 2019 – продвинутое изучение двух кластеров Mycobacterium tuberculosis которые, как нам стало сейчас ясно, представляют две контрастные парадигмы коэволюции значимого патогена человека и Homo sapiens (https://rscf.ru/news/biology/lekarstvenno-ustoychivyy-shtamm/ ; https://rscf.ru/news/biology/shtamm-vozbuditelya-tuberkuleza-obnaruzhennyy-na-dalnem-vostoke-okazalsya-vysokoletalnym/?sphrase_id=104689). Мы надеемся приблизиться к более глубокому пониманию причин и получить ответ на новые вопросы, которые возникли в ходе реализации проекта в 2019-2021 гг. Проекты 2019 и 2022 представляют собой единое и фактически ставшим непрерывным исследование ранее открытых нами (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30528901/) эмерджентных актуальных генотипов Mycobacterium tuberculosis, с переходом в 2022-2023 годах к новым постгеномным и другим технологиям (протеомика, транскриптомика, иммуногистохимия), развитием использованных моделей в новом формате (терапевтическая модель экспериментального туберкулеза) и при новом географическом расширении (репликация исследования летальности в новой выборке и на новой территории). Мы планируем продолжение исследования одновременно по нескольким направлениям и добавление новых, что позволит получить целостную картину эволюции, филогеографии, геномной эпидемиологии и патобиологии эмерджентных, потенциально эпидемических генотипов M. tuberculosis Beijing 14717-15 и Beijing 1071-32. Более того, в исследование будут включены (как в качестве контрольных так и самодостаточных по своей клинической значимости и научному интересу) и другие интересные генетические варианты Mycobacterium tuberculosis – эпидемические варианты Beijing B0/W148 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23554420/), Central Asian Outbreak (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31043465/), Central Asian Russian (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29142045/), которые циркулируют в России и распространены в мире. Проект 2022 построен на основе знаний как фундаментальных, так и прикладных, полученных в Проекте 2019. Развитие нового проекта будет идти через углубление и расширение сравнительных исследований кластеров Beijing 14717-15 и Beijing 1071-32, имея целью: (1) интерпретацию выявленных геномных и популяционных различий на основе новых результатов протеомного и транскриптомного анализа; (2) построение более достоверной сравнительной филогеографии двух кластеров и датировки их возникновения на основе анализа новых геномных данных и новых популяционных коллекций, в т.ч. благодаря нашим международным коллаборациям; (3) понимание выявленных фенотипических различий в мышиной модели через иммунногистохимический анализ имеющегося патологического материала; (4) новое и более реалистичное моделирование туберкулезной инфекции в формате терапевтической модели экспериментального туберкулеза в мышах, в том числе использование характеристики параметров аденозинового метаболизма для дополнительной оценки выраженности воспалительного процесса; (5) верификацию в новом регионе (Бурятия) полученных результатов по повышенной летальности Beijing 14717-15 в популяции. Также можно отметить, что в новом проекте будут использованы и развиты методы, разработанные в ходе проекта 2019 для ПЦР-детекции кластеров древней сублинии генотипа Beijing. Обоснование достижимости. Гарантия успеха – участники проекта: (1) ядро научной группы - представители ведущих лабораторий России из СПб и Иркутска, имеющие европейское и мировое признание в области исследований молекулярной эволюции, эпидемиологии и геномной биоинформатики возбудителя туберкулеза, (2) члены группы из СПб, Омска, Иркутска и Бурятии, что обеспечит географическую репрезентативность и широту охвата, (3) наличие широкой сети международных коллабораторов (Япония, Китай, Казахстан, Нидерланды/ECDC, Албания, Греция, Латвия, Португалия, Франция) что создаст возможность получения широкой пространственной геногеографической перспективы. Профессиональный и научный опыт членов группы полностью соответствует направлениям реализации проекта и поставленным задачам. По Проекту 2019 опубликовано 7 статей, все в журналах Q1 (пять из них с IF 5 - 7). Две статьи 2021 года отражены в СМИ и Новостях РНФ https://www.rscf.ru/news/biology/shtamm-vozbuditelya-tuberkuleza-obnaruzhennyy-na-dalnem-vostoke-okazalsya-vysokoletalnym/ https://rscf.ru/news/biology/lekarstvenno-ustoychivyy-shtamm/ . Соответственно, поставленная задача публикации 10 статей за два года продленного проекта (фактически, май 2022 – декабрь 2023) достижима. Мы полагаем, что все поставленные задачи достаточно значимы и масштабны и будут успешно решены, а полученные новые результаты будут иметь мировой приоритет и общебиологический интерес для понимания молекулярных основ коадаптации человека и патогенных микобактерий.

Ожидаемые результаты
Все полученные результаты будут новыми, будут иметь мировой приоритет и общий и конкретный интерес для общей биологии и биомедицины и позволят приблизиться к пониманию более общих единых предпосылок возникновения эмерджентных резистентных кластеров Mycobacterium tuberculosis, движущих сил их распространения в мире, в особенности в уязвимых популяциях и группах риска. Это станет базой для лучшего понимания других подобных патогенов и развития превентивных мер как для диагностики, так и для эпидемиологии и выбора адекватного лечения. (1) Будет дана оценка эпидемиологической и клинической значимости и степени летальности различных генотипов в том числе древней и современной сублиний генотипа Beijing Mycobacterium tuberculosis на основании статистического анализа всех данных по штаммам и больным. Значимость: развитие персонализированной медицины не только с учетом лекарственной устойчивости, но вирулентности и летальности штамма. (2) Будет дана более точная оценка уровня кластеризации и соответственно трансмиссивности разных генотипов, на основе типирования дополнительных гипервариабельных VNTR-локусов. Будет дана оценка времени возникновения и источника происхождения высокорезистентных российских кластеров древней сублинии генотипа Beijing. Значимость: информированный молекулярно-эпидемиологический мониторинг циркуляции наиболее опасных резистентных и гипервирулентных штаммов Mycobacterium tuberculosis и прогноз их распространения. (3) Будет разработан метод детекции одновременно двух высокорезистентных кластеров (гиперлетального «бурятского» 14717-15 и «омского» 1071-32) в формате ПЦР в реальном времени (4 LNA зонда), и подготовлена заявка на патент. Метод детекции двух кластеров в единой РТ-ПЦР (4 зонда) будет отработан на клиническом материале. Значимость для ускоренной генодиагностики наиболее опасных генетических вариантов. (4) В результате иммуногистохимического исследования патологического материала от мышей будут определены морфологические и молекулярные механизмы повреждения легочной ткани при инфицировании различными штаммами M. tuberculosis, демонстрирующими возникновение различных клинических форм развития заболевания и активности туберкулезного воспаления. Будут сделаны выводы об особенностях течения заболевания при инфицировании различными штаммами M. tuberculosis, выявлении молекулярных точек повреждения с возможным таргетным влиянием на них при лечении. Значимость: развитие персонализированной медицины не только с учетом лекарственной устойчивости, но вирулентности и летальности штамма. (5) Будет получена характеристика дифференциальной экспрессии генов основных эпидемических и эндемических вариантов генотипа Beijing (эпидемические клоны B0/W148, Central Asian Outbreak, 1071-32 и 14717-15). (6) Будет дана оценка характерных протеомных особенностей кластеров древних и современных сублиний Beijing по сравнению с референтным штаммом H37Rv на основе количественного протеомного анализа. Значимость: анализ совокупных транскриптомных, протеомных и геномных данных послужит для выяснения потенциальных факторов патогенности кластеров Beijing. (7) Будет дана оценка эффективности противотуберкулезного лечения у модельных животных в условиях туберкулезной инфекции, вызванной внутривенной инокуляцией клинических изолятов микобактерий, на основании комплекса полученных параметров. Будет получена информация по биохимическим маркерам системной воспалительной реакции в мышах, зараженных разными штаммами. Значимость: совокупные данные, полученные в результате реализации предлагаемого проекта, помогут в решении масштабной задачи по разработке персонализированных схем лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза, на основе взаимоотношения патогена с организмом модельного животного и антимикробным агентом. (8) Многокомпонентный анализ последовательных изолятов M. tuberculosis в терапевтической модели на мышах позволит оценить изменения бактериального метаболизма во время противотуберкулезной терапии. На основании данных полногеномного секвенирования (WGS) будет определено ступенчатое накопление полиморфизмов, объясняющих возникновение фенотипической устойчивости к фторхинолонам и высоким концентрациям изониазида. Значимость: на протеомном и транскриптомном уровнях будут обнаружены изменения в локусах, связанных с лекарственной устойчивостью и вирулентностью, которые лишь частично можно объяснить мутациями в соответствующих участках генов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью исследования является комплексный углубленный анализ патобиологических и геномных характеристик высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории и прогноза на будущее. 2 статьи приняты к публикации, еще 4 статьи на рассмотрении в международных (Emerg Ibfect Dis, Clin Microbiol Infect, 2-Microorg.), и 1 в русском журналах (Acta Biomed Sci). Подготовлена заявка на патент ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ РЕГИОНАЛЬНЫХ КОЛЛЕКЦИЙ ШТАММОВ И ДНК MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Северо-Запад России: Архангельская область. Изучено 89 штаммов M. tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом в Архангельской области. Лекарственной устойчивостью обладали 41,6% (37/89), МЛУ - 33,7% штаммов. У 90% (27/30) МЛУ-штаммов устойчивость к рифампицину и изониазиду была обусловлена мутациями rpoB Ser531Leu и katG Ser315Thr. Выявлены генотипы M. tuberculosis: Beijing (67,4%), T (14,6%), Ural (4,5%), Haarlem (4,5%), LAM (2,3%) и CAS1-Delhi (1,1%). Среди штаммов Beijing преобладали кластеры Central-Asian/Russian (60%; 36/60) и B0/W148 (30%; 18/60). Большинство МЛУ-штаммов принадлежали к семейству Beijing (93,3%; 28/30), из которых 64,3% (18/28) и 21,4% (6/28) принадлежали к кластерам B0/W148 и Central-Asian/Russian соответственно. Западная Сибирь: Омская область. Генотипированы 247 штаммов M. tuberculosis выделенных от больных туберкулезом в Омске и Омской области. В изученной выборке штаммов M. tuberculosis лидирующим было генетическое семейство Beijing преимущественно (69,4%) кластера Central Asian Russian. Для штаммов эпидемиологически и клинически значимого кластера В0/W148 было характерно преобладание МЛУ/ Пре-ШЛУ -штаммов (90,4%). Древняя сублиния Beijing представлена преимущественно МЛУ-штаммами кластера 1071-32. Также выявлены штаммы T, LAM, Haarlem и Ural. Все штаммы SIT262 генотипа Ural обладали МЛУ. Дальний Восток: Бурятия. Исследованы 200 изолятов M. tuberculosis от больных с впервые выявленным туберкулезом в Бурятии 2021-2022 гг. 127 изолятов относены к генотипу Beijing (63.5%). Из них 15 образцов принадлежали кластеру Beijing 14717-15. Среди Beijing 14717-15 кластера статистически значимо преобладали лекарственно устойчивые изоляты (93,3%) (p<0.01). При сравнении образцов из Улан-Удэ и других районов, доли генотипа Beijing и кластера 14717-15 оказались почти одинаковыми. Относительное количество Beijing 14717-15 снизилось по сравнению с предыдущими данными. Доля генотипа Beijing 14717-15 была выше среди больных с тюремным прошлым, что показывает большую трансмиссивность этих штаммов. Поиск российских эпидемических кластеров за пределами России Мы проанализировали популяционную структуру популяции резистентных и чувствительных M.tuberculosis в Польше, ее динамические изменения и географические закономерности в европейском и северо-евразийском контексте. Данные сполиготипирования и VNTR-типирования сравнивали с данными, имеющимися в России, Польше и соседних странах. Все изоляты были отнесены к четырем линиям, в основном L4 (62), и L2 (25). В коллекции с лекарственной устойчивостью преобладал генотип Beijing, и почти все изоляты Beijing были MDR или pre-XDR. Все 9 пациентов, рожденных в странах бывшего Советского Союза, были инфицированы штаммами МЛУ, генотипами Пекин или Урал. По сравнению с ситуацией двадцатилетней давности мы наблюдаем заметный рост генотипа Пекин и некоторое увеличение генотипа Урал среди резистентных штаммов. Продолжается передача пекинских изолятов МЛУ, импортированных в основном из стран бывшего Советского Союза. ФИЛОГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО И ЛЕТАЛЬНОГО «БУРЯТСКОГО» ГЕНОТИПА BEIJING 14717-15 На глобальном филогенетическом дереве M. tuberculosis Beijing с интактным RD181 все российские изоляты кластера Beijing 14717-15 сгруппированы вместе, а их соседями были изоляты из Кореи. Российский кластер отличался от ближайших корейских изолятов по 144 SNP. Все изоляты Beijing 14717-15-кластера содержали сигнатуру двух мутаций мутаций устойчивости katG Ser315Thr и rpsL Lys88Arg. Новое дерево с дополнительными российскими геномами показывает по-прежнему уникальную ветвь российских штаммов, которые в то же время можно разделить на более гетерогенную дальневосточную и менее крупную и вторичную западносибирскую. Судя по количеству SNP, разделяющих наиболее отдаленные изоляты этого кластера, он мог возникнуть в 1950-х гг. Далее мы определили полиморфизмы, характерные для российского кластера Beijing 14717-15. Значения SIFT P были рассчитаны для 32 несинонимичных мутаций. В результате было обнаружено, что 12 SNP в генах разных категорий (обмен липидов, регуляторные белки, промежуточный метаболизм и дыхание, PE/PPE, клеточная стенка и клеточные процессы) существенно влияют на функцию белка (P<0,05). Среди SNP специфичных для кластера Beijing 14717-15, мы выбрали функционально нейтральный SNP в гене Rv1293 и разработали анализ ПЦР в реальном времени для его обнаружения. Метод был применен для анализа ДНК повторно выделенной из мокроты 15 больных зараженных штаммом генотипа 14717-15 и 96 штаммами других генотипов в качестве контрольных. В результате выявлено совпадение результатов анализа ДНК из чистой культуры и из мокроты. Подготовлена заявка на патент. CРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЛЕЧЕНИЯ У МЫШЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ ШТАММАМИ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ M. TUBERCULOSIS Согласно плану работ в сентябре начат опыт изучения эффективности химиотерпаии в мышиной модели с использованием групп мышей, зараженных штаммами различных генотипов. Опыт будет завершен в апреле 2023 года. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Проведено исследование дифференциальной экспрессии определенных (ранее валидированных) генов, ассоциированной с ответом штаммов на воздействие антибиотика (устойчивых vs чувствительных). Такой анализ должен позволить выявить штаммы устойчивые к определенным антибиотикам. Анализировали классический антибиотик изониаид и новый препарат линезолид. В результате различий профиля транскрипции определенных генов (3 конститутивных и 6 индуцибельных) не выявлено. Повторение эксперимента для анализа устойчивости к линезолиду также не позволило диффернцировать чувствительные и устойчивые штаммы. Причины неуспеха могут быть связаны с деградацией РНК на этапе пробоподготовки в бактериологической лаборатории до начала использования наборов QuantiGene Plex Термо Фишер или с особенностями структуры популяции российских штаммов. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА ОТ МОДЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ (начато раньше, чем запланировано) Подготовительная работа в 2022 году. Проанализирован влажный архив ранее проведенного эксперимента (группы зараженные штаммами M. tuberculosis: H37Rv, 396 и 6691) с извлечением материала от животных, выведенных из эксперимента на 14, 21, 60 и 120 дни. Фиксированный в формалине биологический материал был расформирован по гистологическим кассетам, промаркирован соответственно группам, для последующей гистологической проводки. Проводка осуществлялась с применением автоматической системы STP 120 (ThermoFS, USA) с последующим помещением образцов в парафин и изготовлением гистологического блока, обеспечивающего сохранность биоматериала и возможность изготовления срезов для проведения гистологического и молекулярных методов исследования. Исследование будет продолжено в январе-феврале 2023 года после получения заказанных реактивов.

Публикации

1. Вязовая А.А., Елисеев П.И., Герасимова А.А., Соловьева Н.С., Никишова Е. И., Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Марьяндышев А.О. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг популяции возбудителя туберкулеза в Архангельской области Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2023;100(5):online-first (год публикации - 2023) https://doi.org/10.36233/0372-9311-299

2. Мокроусов И.В., Вязовая А.А., Бадлеева М.В., Герасимова А.А., Белопольская О.Б., Машарский А.Э., Костюкова И.В., Жданова С.Н., Мударисова Р.С., Авадэний И., Соловьева Н.С., Скиба Ю.А., Журавлев В.Ю., Пасечник О.А., Огарков О.Б. Молекулярная детекция и филогеография гипервирулентного геноварианта Mycobacterium tuberculosis Beijing 14717-15 Инфекция и иммунитет, Т. 13, № 1, с. 91–99 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.15789/2220-7619-MDA-2082

3. Вязовая А., Герасимова А., Соловьева Н., Журавлев В., Мокроусов И.. Primary multidrug resistance and major clusters of the epidemiologically significant Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Northwest Russia XVth National Congress of Bulgarian Microbiologists with International Participation, Koprivshtica, Bulgaria, 5-8 October 2022, С.82 (год публикации - 2022)

4. Мокроусов И. Pathobiology and phylogenomics of M. tuberculosis Beijing and LAM genotypes in Russia International Conference on the Evolution and Paleoepidemiology of Tuberculosis (ICEPT) ICEPT-3 – Tuberculosis in Evolution (5-6 July 2022, Szeged, Hungary), https://www2.bio.u-szeged.hu/icept-3/doku.php/abs:makrousov (год публикации - 2022)

5. Мокроусов И. Epidemic and endemic Mycobacterium tuberculosis clusters in Russia: pathobiology and phylogeography XVth National Congress of Bulgarian Microbiologists with International Participation, Koprivshtica Bulgaria, 5-8 October 2022, С.72-73 (год публикации - 2022)

6. Мокроусов И.В., Пасечник О.А., Ярусова И.В., Вязовая А.А. Влияние патобиологического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на клинику и летальный исход туберкулеза Проблемы медицинской микологии, Т.24, №2, С.103-104 (год публикации - 2022)

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью исследования является комплексный углубленный анализ патобиологических и геномных характеристик высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории, динамической филогеографии, их взаимосвязи и взаимовлияния. В 2023 году опубликовано или принято в печать 10 статей (с учетом Q1), сделано 12 докладов, в т.ч. на 3 международных конференциях. Две публикации в СМИ и соответствующих Новостях РНФ: (https://www.rscf.ru/news/biology/virulentnost-nedootsenennyy-faktor-rasprostraneniya-shtammov-m-tuberculosis/ ; https://www.rscf.ru/news/biology/multidistsiplinarnoe-issledovanie-posvyashcheno-tuberkulezu-v-sibiri-xviii-xix-vekov/). В частности, работы велись по следующим направлениям: РАСШИРЕННЫЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕНОМИКИ И ФИЛОГЕОГРАФИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО И ЛЕТАЛЬНОГО БУРЯТСКОГО КЛАСТЕРА BEIJING 14717-15. В коллекцию исследования вошли в разных регионах мира. Филогеномный и филогеографический анализ ДНК M. tuberculosis, собранных с 1996 по 2020 годы и извлеченных их геномных баз данных подтвердил эндемическую распространенность кластера Beijing 14717-15 в азиатской части России и наличие дальнего общего предка с изолятами из Кореи (>115 SNP). Российские изоляты этого кластера были из Азиатской России, а 4 изолята - из Нидерландов и Испании. Кластер-специфичные SNP, которые существенно влияют на функцию белка, были идентифицированы in silico в генах разных категорий. ДИНАМИКА МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ M. TUBERCULOSIS В БУРЯТИИ. 200 штаммов микобактерий туберкулеза, полученных от впервые выявленных пациентов, были подвергнуты фенотипическому тестированию на лекарственную чувствительность и генотипированию основных эпидемических и эндемичных линий и кластеров. Генотип Beijing чаще выделялся у русских, чем у бурят (68% против 53%). Российский эпидемический кластер B0/W148 выявлен в 9,5%, что меньше, чем в других районах Сибири. Beijing 14717-15 (7,5%) оказался эндемичным для Бурятии, но, как это ни парадоксально, он чаще выделялся от русских, чем от бурят (8,7% против 3,9%). Более высокая распространенность генотипа Beijing в целом среди бывших заключенных (79% против 61% у остальных пациентов) предполагает его повышенную заразность. Структура M. tuberculosis и тенденции лекарственной устойчивости в Бурятии в основном аналогичны таковым в других частях России, при этом все штаммы относятся либо к L2 (восточноазиатская линия), либо к L4 (евро-американская линия), а уровень распространенности штаммов МЛУ высок (23%). Анализ корреляции генотипа M. tuberculosis и исхода заболевания не выявил однозначной зависимости. Мы проверили возможность ПЦР-РВ детекции одновременно для двух генетических кластеров генотипа Beijing. Для более экономной реализации мы использовали только кластер-специфические зонды, меченые различными флуорофорами, для выявленния по различным каналам детекции. При использовании качественной ДНК отсутствие сигналов по обоим каналам отражает принадлежность штамма к иному субтипу Beijing. Одновременная детекция была отработана для МЛУ-ассоциированных субтипов В0 (российский успешный клон) и 14717-15 (гипервирулентный бурятский кластер). ВИРУЛЕНТНОСТЬ, ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ И ФИЛОГЕОГРАФИЧЕСКИЕ СДВИГИ ГЕНОТИПОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Мы провели сравнение геномных, фенотипических и патогенетических особенностей штаммов значимого генотипа LAM (Latin-American Mediterranean) M. tuberculosis в контексте их динамической филогеографии за последние двадцать лет. Выявлена нелинейная связь устойчивости, вирулентности и трансмиссии причем более распространена обратная корреляция устойчивости и вирулентности/передачи. Наиболее вирулентный, летальный и чувствительный штамм 306 относится к SIT264. Этот сполиготип раньше был широко распространен, но очень редок, однако наблюдается увеличение его распространенности. Низковирулентный штамм 7074 относится к SIT252. Как штамм, так и этот тип являются как минимум МЛУ, со многими мутациями резистентности и характерными мутационными сигнатурами (rpoB516, inhA-15, katG315). SIT252 считался новым резистентным вариантом в европейской части России 10 лет назад, но недавние исследования показывают снижение его выявления. Увеличение циркуляции чувствительных, но вирулентных и летальных штаммов означает, что персонализированное лечение ТБ должно учитывать не только резистентность, но и вирулентность инфекционных штаммов (это подчеркивает актуальность нового направления разработки т.н. anti-virulence drugs направленных на факторы вирулентности). CРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЛЕЧЕНИЯ У МЫШЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ ШТАММАМИ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ M. TUBERCULOSIS И ГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ СЕРИЙНЫХ ИЗОЛЯТОВ. Значимый эффект противотуберкулезной терапии у мышей, получавших моксифлоксацин, линезолид, бедаквилин, перхлозон зафиксирован на обоих сроках наблюдения. Лечение мышей в течение 5,5 месяцев значимо снизило обсемененность легких M. tuberculosis и коэффициенты масс легких, распространенность в них специфического воспаления и альтеративного компонента воспаления. Самая высокая эффективность проведенной терапии отмечена у мышей, зараженных наименее вирулентными штаммами 6691 (Beijing 14717-15) и 7074 (LAM SIT252). Анализ выживаемости показывает, что ни одна мышь не умерла в трех из четырех групп, получивших химиотерапию. Лишь в одной группе мышей, инфицированных гипервирулентным и высоколетальным штаммом 396 (Beijing 14717-15), летальные случаи отмечались, но значительно реже по сравнению с контрольной группой. Выделенные изоляты M. tuberculosis подвергали WGS. Мутантные аллели не были идентифицированы даже в малой доле. Таким образом, правильный режим химиотерапии и соблюдение пациентами режима лечения являются ключом к борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА ОТ МОДЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ. Молекулярно-биологическими методами проведено изучение экспрессии белков iNOS, TNF-a, IL12, IL6, CD19, CD3 и CD68 в ткани легких мышей, зараженных штаммами Mycobacterium tuberculosis H37Rv, 396 и 6691, и выведенных из эксперимента на 14, 21, 60 и 120 день. Проведенное исследование позволило выяснить, что штамм Mycobacterium tuberculosis 396 вызывает более раннее развитие деструкции и гнойного воспаления, по сравнению со штаммами H37Rv и 6691, что сопровождается значительным повышением синтеза сигнальных молекул iNOS и TNF-a на всем протяжении исследования. ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ НИЗКО- И ВЫСОКОВИРУЛЕНТННЫХ ШТАММОВ. Выявлена дифференциальная экспрессия 6 генов: 5 генов значимо выше у низковирулентного штамма 6691 и 1 ген у высоковирулентного штамма 396. В частности интерес представляет сильнее экспрессируемый у 6691 регуляторный ген IdeR (железо-зависимый репрессор и активатор IdeR) про который известно что он регулятор транскрипции, железосвязывающий репрессор биосинтеза сидерофоров и поглощения железа. Также сильнее экспрессируемый у 6691 белок, индуцируемый повреждением компетентности CinA представляет определенный интерес для дальнейшего изучения. Значимо выше уровень экспрессии у высоковирулентного и летального штамма 396 («бурятский субтип») был у гена Rv2277c (кодирует глицеролфосфодиэстеразу). ПАЛЕОПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОСТНЫХ ОБРАЗЦОВ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ДРЕВНЕЙ ДНК M. TUBERCULOSIS. Анализ ДНК из скелетов с морфологическими изменениями, связанными с туберкулезом, с православных кладбищ XVIII - начала XIX веков в Иркутске показал, что по крайней мере у четырех человек (из 15 с подозрением на туберкулез, прошедших ДНК-тестирование) было обнаружено наличие ДНК M. tuberculosis. Комбинированный молекулярный анализ позволил сделать осторожное предположение о наличии различных штаммов, и по крайней мере некоторые из них представляли не преобладающий в настоящее время в Сибири генотип Beijing (восточно-азиатская линия M.tuberculosis), а штаммы европейского (российского) происхождения.

Публикации

1. Вязовая А., Герасимова А., Мударисова Р., Терентьева Д., Соловьева Н., Журавлев В., Мокроусов И. Genetic Diversity and Primary Drug Resistance of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype Strains in Northwestern Russia Microorganisms, 11 (2): 255 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/microorganisms11020255

2. Вязовая А.А., Костюкова И.В., Герасимова А.А., Терентьева Д.Р., Пасечник О.А., Мокроусов И.В. Лекарственная устойчивость различных генотипов mycobacterium tuberculosis в Омской области России Микробиология, - (год публикации - 2024)

3. Костюкова И., Пасечник О., Мокроусов И. Epidemiology and Drug Resistance Patterns of Mycobacterium tuberculosis in High-Burden Area in Western Siberia, Russia Microorganisms, 11 (2): 425 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/microorganisms11020425

4. Костюкова И.В., Пасечник О.А., Мокроусов И.В. Эпидемиологические проявления туберкулёзной инфекции в Омской области: динамика и тенденции Acta biomedica scientifica, Т. 8, №2, С. 263-271 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.29413/ABS.2023-8.2.26

5. Мокроусов И., Виноградова Т., Догонадзе М., Заболотных Н., Вязовая А., Витовская М., Соловьева Н., Ариэль Б. A multifaceted interplay between virulence, drug resistance, and the phylogeographic landscape of Mycobacterium tuberculosis Microbiology Spectrum, V. 11, N 5, P. e01392-23 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1128/spectrum.01392-23

6. Мокроусов И., Вязовая А., Шитиков Е., Бадлеева М., Белопольская О., Беспятых Д., Герасимова А., Иоаннидис П., Цзяо В., Хромова П., Машарский А., Найзабаева Д., Папавенцис Д., Пасечник О., Пердигао Ж., Растоги Н., Шен А., Синьков В., Скиба Ю., into pathogenomics and phylogeography of hypervirulent and highly-lethal Mycobacterium tuberculosis strain cluster BMC Infectious Diseases, 23(1):426 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1186/s12879-023-08413-7

7. Харламова Н., Огарков О., Бердников И., Бердникова Н., Галеев Р., Мокроусов И. Bioarchaeological and molecular evidence of tuberculosis in human skeletal remains from 18th-19th century Orthodox cemeteries in Irkutsk, Eastern Siberia Tuberculosis (Edinb.), 143: 102368 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.tube.2023.102368

8. Вязовая А.А., Герасимова А.А., Мударисова Р.С., Терентьева Д.Р., Cоловьева Н.С., Журавлев В.Ю., Мокроусов И.В. Mycobacterium tuberculosis c множественной лекарственной устойчивостью: генотипическая характеристика Молекулярная диагностика и биобезопасность-2023: сборник тезисов Конгресса с международным участием (Москва, 27–28 апреля 2023 г.) / под ред. академика РАН В.Г. Акимкина — М.: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, С. 56-57 (год публикации - 2023)

9. Вязовая А.А., Пасечник О.А., Костюкова И.В., Герасимова А.А., Терентьева Д.Р., Мокроусов И.В. Лекарственная устойчивость различных генотипов Mycobacterium tuberculosis в Западной Сибири Тезисы. 4 Российский Микробиологический Конгресс, Томск 24 – 29 сентября 2023, С. 147-148 (год публикации - 2023)

10. Мокроусов И.В. Структура популяции Mycobacterium tuberculosis: краткий обзор некоторых факторов ее формирования Тезисы. 4 Российский Микробиологический Конгресс, Томск 24 – 29 сентября 2023, С.130 (год публикации - 2023)

11. Мударисова Р.С., Бадлеева М.В., Вязовая А.А., Мокроусов И.В. Современная структура популяции Mycobacterium tuberculosis в Республике Бурятия Тезисы. 4 Российский Микробиологический Конгресс, Томск 24 – 29 сентября 2023, С.154-155 (год публикации - 2023)

12. - Вирулентность — недооцененный фактор распространения штаммов M. tuberculosis PCR.NEWS, Mokrousov et al. A multifaceted interplay between virulence, drug resistance and phylogeographic landscape of Mycobacterium tuberculosis // Microbiology Spectrum 2023 Sep 28:e0139223. DOI: 10.1128/spectrum.01392-23 (год публикации - )

13. - В Иркутске XVIII века циркулировал штамм M. tuberculosis, вероятно, занесенный из Европейской части России PCR.NEWS, Kharlamova N., .... Mokrousov I.Bioarchaeological and molecular evidence of tuberculosis in human skeletal remains from 18th-19th century Orthodox cemeteries in Irkutsk, Eastern Siberia // Tuberculosis (Edinb.) 2023 143: 102368. (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Полученные данные о маркерных мутациях для эпидемических и клинически значимых кластеров штаммов микобактерий туберкулеза могут быть использованы для обновления существующих систем молекулярной диагностики эпидемиологически и клинически значимых генотипов Mycobacterium tuberculosis и слежения за их циркуляцией. Разработанные методы детекции кластеров M. tuberculosis (мультирезистентный Beijing 1071-32 и мультирезистентный, высоколетальный Beijing 14717-15) могут быть внедрены в практику эпиднадзора за туберкулезом в России и для совершенствования персонализированной медицины с учетом не только лекарственной устойчивости но и гипервирулентности штамма. Исследование терапевтической модели экспериментального туберкулеза на мышах показало. что правильный режим химиотерапии и соблюдение пациентами режима лечения являются ключом к борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом.