Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на продолжение исследований особенностей регуляции клеточных функций мозга под действием пептидных препаратов в норме, при остром стрессе и экспериментальной ишемии. В отчетный период была осуществлена пробоподготовка и секвенирование фракции циклоРНК дорсолатерального участка лобной коры крыс на основе полученных ранее образцов РНК. Проведен RNA-Seq-анализ изменения содержания циклоРНК в участках мозга животных под воздействием ишемии-реперфузии (IR), а также под воздействием пептидов – производных меланокортина - семакса (IS) и АКТГ(6-9)PGP (IA) при ишемии. Было выявлено 12457 циклоРНК, сотни из которых были дифференциально экспрессированными циклоРНК (ДЭЦ) (кратность >1,5; p<0,05) как под действием ишемии, так и каждого из пептидов через 24 ч после tMCAO. Сопоставление результатов RNA-Seq в разных группах сравнения позволило выявить перекрывающиеся и уникальные циклоРНК, изменение уровня которых в клетках дорсолатерального участка лобной коры крыс связано с действием пептидов при ишемии. В частности, мы обнаружили 115 циклоРНК, изменивших экспрессию как при воздействии ишемии, так и каждого из пептидов. Все циклоРНК из указанного пересечения сонаправленно изменили уровень под действием обоих пептидов, при этом ДЭЦ, которые повысили уровень при ишемии (89), снизили его под действием пептидов и, наоборот, 26 циклоРНК, снизившие уровень при ишемии, повысили его под действием пептидов. Результаты показывают компенсаторный характер влияния пептидов на изменение уровня регуляторных циклоРНК-молекул в дорсолатеральном участке лобной коры крыс, направленный на коррекцию профиля экспрессии, нарушенного воздействием ишемии. В проекте мы также провели сравнение профилей дифференциальной экспрессии циклоРНК и мРНК в дорсолатеральном участке лобной коры крыс через 24 ч после tMCAO и действии пептидов. В результате, мы показали, что циклоРНК, кодируемые теми же генами, что и мРНК, часто не воспроизводят профиль последних, что указывает на независимость пути регуляции их представленности в клетках мозга. Семакс и АКТГ(6-9)PGP при этом способны оказывать компенсирующее влияние как на уровне мРНК, так и циклоРНК при ишемии, что в значительной степени расширяет спектр активности пептидов на модуляцию геномной активности в мозге. На следующем этапе, в результате постановки ранее отработанной модели tMCAO под контролем МРТ и использования метода RNA-Seq мы оценили транскрипционную активность 17367 генов в стриатуме поврежденного полушария мозга крыс через 24 ч после tMCAO и при введении пептидов семакса и АКТГ(6-9)PGP. Были выявлены 2364, 343 и 735 дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ) (кратность >1,5; padj<0,05) как в ответ на ишемию-реперфузию относительно ложнооперированных животных, так и на воздействие семакса и АКТГ(6-9)PGP относительно ишемизированных животных, получающих физраствор, соответственно. Использование метода ОТ-ПЦР в реальном времени для генов Hspb1, Mmp9 и Cxcl16 при нормализации с помощью Gapdh позволило верифицировать результаты RNA-Seq на расширенной выборке животных. По данным RNA-seq в образцах стриатума были обнаружены как общие ДЭГ, так и свойственные индивидуально каждой группе сравнения исследованных животных. Следует отметить 182 гена, изменивших экспрессию одновременно под действием ишемии и каждого из пептидов, 173 гена из их числа сонаправленно изменили уровень экспрессии под действием пептидов, но в противоположном направлении от изменения экспрессии ДЭГ при ишемии. Результаты показывают меньшую выраженность влияния пептидов в сравнении с эффектом самой ишемии, и вместе с тем выражают спектр активности пептидов на модулирование профиля экспрессии генов в стриатуме поврежденного полушария мозга крыс. Для дальнейшего анализа ДЭЦ были получены библиотеки для секвенирования RNAse-R-устойчивой фракции циклоРНК стриатума. C целью соотнесения результатов по экспрессии генов, полученных в модельных системах ишемии мозга, с геномными характеристиками человека и оценки их роли в патогенезе острого ишемического инсульта был также проведен анализ 786 генов крысы, значимо изменивших экспрессию в дорсолатеральном участке лобной коры крыс как под действием ишемии, так и пептидов семакса и АКТГ(6-9)PGP через 24 ч после tMCAO. Для 626 генов из них были найдены 628 ортологов человека. Используя данные проекта 1000 геномов (популяция CEU), был изучен полиморфизм каждого из генов и найдены однонуклеотидные полиморфные локусы (SNPs) с максимальным числом ассоциаций с другими локусами (tagSNPs; r2 ≥ 0.8). Среди них были идентифицированы SNPs, способные влиять на экспрессию соответствующих генов (eQTLs) и отфильтрованы по типу тканей (Brain, Artery, Blood и Heart). Для оптимизации возможностей исследования ассоциаций с ишемическим инсультом все связанные с tagSNPs-eQTLs гены были ранжированы путем анализа их сверхпредставленности в наборах генов метаболических путей в терминах генной онтологии. Анализ выявил четыре биологических процесса, в которых многие из исследованных генов были статистически значимо сверхпредставленны. Ориентируясь на данные об изменении экспрессии генов, а также их вовлеченности в более чем один процесс, из них были отобраны более 10 генов-кандидатов. Далее в каждом гене были отобраны от 1 до 3 tagSNPs для проведения ассоциативного анализа. Для отобранных tagSNPs были подобраны условия их генотипирования методом ПЦР в режиме реального времени TaqMan. В ходе тестирования условий ПЦР на выборке образцов ДНК из представителей московской популяции русских (30 чел.) были также определены частоты аллелей каждого из tagSNPs. Частоты встречаемости большинства из них оказались близкими таковым в популяции CEU. Новые образцы крови собирались у больных инсультом и здоровых лиц обоего пола 55 лет и старше. Диагноз ишемического инсульта ставился на основании жалоб, данных анамнеза и объективного обследования больных, результатов лабораторных и инструментальных методов исследования. За истекший период были собраны образцы крови у 439 индивидов и выделена ДНК из 251 из них. Также в отчетный период нами было продолжено изучение влияния пептидных препаратов семакс и селанк на последствия острого стрессогенного воздействия. Изучение влияния семакса на изменения поведения крыс в различных экспериментальных моделях острого стресса, показало, что пептид не влияет на краткосрочные изменения поведения животных, вызванные острыми стрессогенными воздействиями различной природы. При оценке влияния пептидов на отставленные эффекты острого стресса была использована модель однократной иммобилизации длительностью 1 час, поведение животных оценивали в тестах приподнятый крестообразный и О-образный лабиринты через 1.5 и 4 часа после стресса, соответственно. Было показано, что использованное воздействие приводило к гиперактивности и повышенной импульсивности крыс в условиях, провоцирующих реакции тревоги и страха. Предварительное введение семакса нормализовало эмоциональное состояние животных, перенесших стресс. Предварительное введение селанка не влияло на последствия использованного стрессогенного воздействия. Получены образцы тканей мозга животных для дальнейшего изучения влияния пептидных препаратов на транскриптом мозга крыс. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, были доложены на V Национальном конгрессе по регенеративной медицине (23 - 25 ноября 2022 года, Москва, Россия) в форме 3 постерных докладов. Тезисы опубликованы в журнале «Гены и клетки» (Scopus). По результатам первого года работы над проектом опубликована 1 статья (Q1), 2 статьи приняты в печать, по 1 статье (Q1) получены положительные рецензии. Издания индексируются в базах данных Web of Science или Scopus.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчетный период проведен сравнительный анализ уровня мРНК и циклоРНК в образцах дорсолатеральной коры и стриатума поврежденного полушария мозга крыс после обратимой окклюзии правой средней мозговой артерии (tMCAO) и действия пептидов семакса и АКТГ(6-9)PGP относительно соответствующих образцов ложнооперированных и ишемизированных животных. Наибольшее количество дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) выявлено при действии ишемии на кору (3773) и стриатум (4409). Под действием семакса и АКТГ(6-9)PGP в коре крыс изменили экспрессию 1539 и 2066 ДЭГ, в стриатуме - 343 ДЭГ и 735 ДЭГ соответственно. Иерархический кластерный анализ всех ДЭГ в группах сравнения показал сходство воздействия ишемического повреждения на экспрессию генов в исследуемых структурах мозга крыс. При этом эффект пептидов, направленный на компенсацию профиля экспрессии генов, нарушенного действием ишемии, выражен в лобной коре, в то время как в стриатуме он значительно менее заметен. Аналогичный анализ дифференциально экспрессирующихся циклоРНК (ДЭЦ) показал количество пересекающихся и уникальных ДЭЦ при ишемии и действии пептидов в двух исследуемых тканях мозга. Иерархический кластерный анализ всех ДЭЦ в группах сравнения также свидетельствует о меньшей выраженности влияния пептидов на уровень циклоРНК в стриатуме, чем в лобной коре. Более того, в образцах стриатума и лобной коры АКТГ(6-9)PGP и семакс оказывают противоположное действие на уровень экспрессии нескольких ДЭЦ, что может характеризовать данные циклоРНК как возможные интеграторы или переключатели в контроле активности процессов с участием пептида в разных участках поврежденного полушария мозга крыс после ишемии. Анализ всех генов, кодирующих ДЭЦ и соответствующие мРНК в исследуемых сравнениях показывает, что циклоРНК, образуясь попутно с мРНК, часто не воспроизводят профиль мРНК, указывая на независимость пути регуляции их представленности в клетках мозга. Пептиды при этом способны оказывать влияние как на уровне мРНК, так и циклоРНК при ишемии в зависимости от генеза ткани, что в значительной мере расширяет спектр активности пептидов на модуляцию геномной активности в мозге. На основании сравнительного анализа дифференциальной экспрессии циклоРНК и мРНК в группах сравнения и соответствующего анализа функциональных аннотаций в работе были составлены панели мРНК и циклоРНК, ответственных за процессы, связанные с влиянием ишемии и пептидов семакса и АКТГ(6-9)PGP через 24 ч после tMCAO. С использованием программы функционального обогащения DAVID для ДЭГ (мРНК), а также для циклоРНК, выделенных из дорсолатерального участка лобной коры и стриатума поврежденного полушария мозга крыс были выявлены значимо ассоциированные сигнальные пути и биологические процессы. Через 24 ч после tMCAO действие пептидов в стриатуме и дорсолатеральном участке коры заметно отличалось. Пептиды в коре индуцировали экспрессию генов, направленную на компенсацию их профиля, измененного ишемией – повышали экспрессию генов системы нейросигнализации и снижали экспрессию генов системы воспаления. В тоже время компенсаторной активности пептидов в отношении генов соответствующих систем в стриатуме почти не наблюдалось. Результаты показывают, что в участках мозга, содержащих способные к восстановлению клетки пенумбры (лобная кора) и в зоне, включающей очаг ишемического повреждения (стриатум), участвуют различные сигнальные пути, связанные с ишемическим повреждением и влиянием пептидов с нейропротективными свойствами. Проведен биоинформатический анализ циклоРНК и мРНК взаимодействий, изменивших экспрессию под действием ишемии и при действии пептидов, с микроРНК. Для идентификации сетей конкурентных взаимодействий между мРНК, микроРНК и циклоРНК были выбраны мРНК и циклоРНК, которые способны конкурировать между собой за взаимодействие с одними теми же микроРНК. В качестве примера представлена сеть, связанная с активностью пептида АКТГ(6-9)PGP в дорсолатеральном участке лобной коры крыс. Полученная сеть указывает на множественное взаимовлияние циклоРНК и мРНК через взаимодействия с микроРНК. Используя метод ПЦР в реальном времени, мы генотипировали 11 SNPs из 6 генов в образцах ДНК 553 русских (331 больного инсультом и 222 человек из контрольной группы) и проанализировали их связь с риском развития и исходами ИИ (ишемического инсульта). Мы обнаружили, что SNP rs858239 (GPNMB), rs907611 (LSP1) и rs494356 (TAGLN) были ассоциированы с различными параметрами функциональных исходов ИИ. Кроме того, SNP rs1261025 (PDPN) был значимо ассоциирован с самим ИИ (p = 0,0188, рецессивная модель). Все эти ассоциации были продемонстрированы впервые. Анализ литературы показал, что их следует характеризовать как связанные с процессами воспаления. Это подтверждает ключевую роль воспаления как в развитии инсульта, так и в постинсультных исходах. Проведено исследование долгосрочных эффектов однократного иммобилизационного стресса, а также длительности действия пептидов семакс, АКТГ(6-9)PGP и селанк на эмоциональное состояние белых крыс в норме и после острого стрессогенного воздействия. Получены данные об изменении уровней мРНК в препаратах гиппокампа животных в норме, перенесших острое стрессогенное воздействие, в ответ на введение пептидов селанк и семакс через 6 ч после инъекции, а также пептидов селанк, семакс, АКТГ(6-9)PGP через 24 ч после соответствующей инъекции. В норме, спустя 6ч после введения, семакс привел к изменению экспрессии 16 генов, селанк – не оказал влияния. В условиях эксперимента после острого иммобилизационного стресса в гиппокампе крыс, не получавших пептиды, изменили экспрессию более 4 тысяч генов, под воздействием семакса - 25 генов, тогда как под действием селанка - около 3 тысяч генов. В ответ на стресс и введение селанка при стрессе 2328 ДЭГ показали разнонаправленное изменение экспрессии, 14 генов однонаправленно снизили экспрессию. Таким образом, в условиях стресса селанк более выраженно, чем семакс, компенсирует изменения профиля экспрессии генов, вызванные стрессом, через 6 ч после инъекции пептида. Выявленный профиль экспрессии генов может характеризовать генез противострессового влияния селанка. Действие селанка через 6 ч после стресса было связано с модуляцией 17 сигнальных путей. Они характеризовали как работу иммунной системы, так и систем нейросигнализации и нейрорецепции в гиппокампе крыс. Преимущественно с путями были связаны гены, которые понизили уровень мРНК при стрессе и повысили его под действием селанка. Таким образом, мы выявили метаболические системы, в рамках которых селанк способен оказывать компенсирующее влияние на генетическую активность клеток мозга после действия стресса. Изучение поведения крыс в тесте ПКЛ через 24 ч после стрессогенного воздействия не выявило значимого изменения параметров поведения животных относительно нестрессированного контроля. Следовательно, длительность эффектов острого стрессогенного воздействия, использованного в наших экспериментах, составляет менее суток. Нами не было зарегистрировано влияния пептидов семакс, АКТГ(6-9)PGP и селанк на уровень тревожности животных через 24 ч после инъекции препаратов. По данным RNA-Seq через сутки после стресса в гиппокампе крыс не выявлено выраженных долгосрочных эффектов стресса на транскриптом. Метод ОТ-ПЦР в реальном времени верифицировал результаты RNA-Seq на расширенной выборке, содержащей не менее 7 животных. В ответ на введение пептидов спустя сутки в норме и на фоне стресса изменили экспрессию единичные гены, при этом в группах животных, получавших семакс и АКТГ(6-9)PGP, подвергнутых стрессу, заметна тенденция производных меланокортина к снижению экспрессии генов, повысивших её под действием стресса. Такого влияния не наблюдается под действием селанка, который способен к подобному компенсаторному влиянию на экспресcию генов при стрессе через 6 ч после инъекции. Результат может указывать на время-зависимый характер действия пептидов и запускаемых ими транскриптомных ответов в гиппокампе стрессированных крыс.