Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году в рамках проекта проводились исследования в области поиска новых биологически активных соединений и исследования метаболома человека и экспериментальных животных. Ключевым экспериментальным методом, используемым для решения всех поставленных задач, была спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Методы ЯМР широко используются на всех этапах создания новых лекарственных препаратов, включая исследование структуры и динамических свойств биомакромолекул-мишеней, отбор соединений-хитов, специфически связывающихся с биомишенью, дизайн соединений, обладающих наибольшей аффинностью по отношению к мишени, контроль структуры синтезируемых соединений-лидеров, доклинические исследования метаболизма найденных соединений, исследования влияния биологически активных препаратов на метаболом человека. Практически все из перечисленных исследований выполнялись в рамках настоящего проекта. Был выполнен поиск соединений, обладающих потенциальной антибактериальной активностью, мишенями действия которых являются бактериальная формиатдегидрогеназа из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ) и неорганическая пирофосфатаза из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазы). В ходе исследований, проведенных в 2022 году продолжен начатый ранее поиск соединений, способных специфически связываться с этими ферментами и вызывать ингибирование ферментативных реакций. Для Sa-ФДГ найдены молекулярные фрагменты, обеспечивающие взаимодействие соединений с белком в кармане связывания ко-фактора NAD+. Исследованы ингибирующие свойства серии соединений из коммерчески доступных библиотек, а также синтезированы несколько новых потенциальных ингибиторов Sa-ФДГ. Для одного из них обнаружена ингибирующая активность в биохимической тест-системе in vitro. Намечены пути дальнейшего повышения аффинности синтезируемых соединений этого класса. Синтезировано несколько новых потенциальных ингибиторов Mt-PPазы в ряду производных сульфонафталина и α-аминофосфонатов. Изучены их ингибирующие свойства по отношению к Mt-PPазе с помощью биохимической тест-системы, а также сайты связывания с белком с помощью метода SAR-by-NMR. Для расширения возможностей анализа отношения структура-активность в ряду ингибиторов неорганических пирофосфатаз семейства I дополнительно были проведены биоинформатические исследования данного семейства белков. Идентифицированы семейство-специфичные аминокислотные остатки, расположенные преимущественно во внутритримерном интерфейсе. Установлено, что для большинства этих аминокислотных остатков наблюдаются значимые изменения химических сдвигов и ширин линий амидных групп в спектрах 15N,1H TROSY при взаимодействии белка с природными регуляторами ферментативной активности Mt-PPазы. Таким образом, ингибиторы, связывающиеся с ферментом в карманах, сформированных этими остатками, способны селективно подавлять активность Mt-PPазы не меняя существенно ферментативную активность РРаз из других организмов, включая РРазу клеток человека. Проведены исследования в области применения методов спектроскопии ЯМР и квантовой химии для установления строения новых биологически активных соединений, обладающих антибактериальными и противогрибковыми свойствами, которые были синтезированы или выделены из природных объектов коллегами из МГУ и Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе. Установлено строение нового аналога тетраценомицина X (TcmX), выделенного из актиномицетов Amycolatopsis sp. и являющегося изомером TcmX. Это соединение не проявляет антимикробной активности, хотя отличается от активного аналога лишь положением одной метильной группы. Полученный результат важен для понимания механизма действия тетраценомицинов, как ингибиторов биосинтеза белка на бактериальной рибосоме. Методами спектроскопии ЯМР определено строение конъюгата, сочетающего в структуре макролидный антибиотик десмикозин и фрагмент антимикробного пептида онкоцина. Это соединение, обладающее высокой антимикробной активностью, было синтезирован коллегами из Химического факультета МГУ. Ими же были синтезированы нескольких новых конъюгатов хлорамфеникола и берберина. Механизм антимикробного действия хлорамфикола основан на связывании с пептидилтрансферазным центром бактериальной рибосомы, а фармакологическая активность изохинолинового алкалоида берберин обусловлена действием на клеточную мембрану. Новые конъюгаты показали высокую антибактериальную активность при практически полном отсутствие токсического действия на клетки эукариот. Строение новых синтезированных соединений было подтверждено методами 2D спектроскопии ЯМР. Совместно с коллегами из Института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе проведены исследования по поиску новых соединений, обладающих противогрибковыми свойствами в ряду производных тиазолидин-4-она – аналогов оригинального противогрибкового препарата микозидина. При анализе спектров ЯМР серии новых соединений, полученных путем добавления новых функциональных групп к фармакофорному остову микозидина, обнаружено протекание нескольких неожиданных структурных перегруппировок молекул с раскрытием тиазолидинового цикла и образованием новых гетероциклических соединений. Методами ЯМР исследован механизм этих перегруппировок. Несмотря на замену исходного фармакофорного остова для одного из синтезированных соединений обнаружена высокая активность в отношении штамма Candida parapsilosis. Это позволило расширить структурное разнообразие потенциальных противогрибковых средств. По направлению ЯМР-метаболомных исследований отобрана группа из 135 добровольцев для поиска метаболитов, ассоциированных с приемом экзогенных кетоновых тел (β-гидроксибутирата). У всех добровольцев произведен отбор образцов биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови) до и после курса приема β-гидроксибутирата. Для всех собранных образцов выполнена пробоподготовка и измерены спектры ЯМР. В продолжение начатых ранее исследований по поиску биомаркеров витаминного статуса человека, в 2022 году проведён качественный и количественный анализ образцов биологических жидкостей людей, принимавших витамины D, B1, B6, B9 и B12. Этот анализ позволил выявить несколько веществ, которые потенциально могут служить биомаркерами витаминного статуса. Наиболее значимые различия получены для витаминов B9 и витамина D. Приём витамина B9 приводит к повышению концентраций ароматических и некоторых алифатических аминокислот, а также нескольких других веществ в плазме крови. Приём витамина D приводит к изменению концентрации ацетата, бетаина, аланина, ацетона, аргинина и лейцина. Проведены ЯМР-метаболомные исследования на двух группах мышей с нокаутом по гену Mtln и по гену Mettl15, а также для сравнения на мышах дикого типа. Ген Mtln кодирует небольшой (56 а.о.) пептид, участвующий в регуляции липидного обмена митохондрий, а его инактивация приводит к повышенной активности комплексов дыхательной цепи. Ген Mettl15 кодирует одноименную метилтрансферазу Mettl15, участвующую в метилировании рРНК митохондрий и регуляции правильной сборки митохондриальной рибосомы. Нарушение работы митохондрий, отвечающих за энергетический обмен в клетках, может оказывать влияние на внутриклеточные процессы и дисфункцию всего организма в целом. Установлено, что мышей-нокаутов по гену Mtln происходит накопление соединений, подлежащих окислению в цикле трикарбоновых кислот и их предшественников, а также понижение концентрации интермедиатов этого цикла. Полученные данные свидетельствуют об участии Mtln в бета-окислении жирных кислот. Нокаут гена Mettl15 не привел к значимому изменению концентрации основных метаболитов в крови и моче экспериментальных животных, при том, что комплементарные функциональные и биохимические исследования показали, что нокаутные по Mettl15 мыши демонстрировали пониженную мышечную производительность и более низкие уровни белка Cox3, синтезируемого митохондриальными рибосомами в окислительных камбаловидных мышцах.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году в рамках проекта проведен поиск новых ингибиторов пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазы) и формиатдегидрогеназы из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ) методами ЯМР скрининга, установлена структура и исследованы конформационные свойства серии новых противогрибковых и антибактериальных соединений, выполнен поиск биомаркеров потребления витаминов методами ЯМР метаболомики и проведено исследование влияния нокаутирования нескольких генов на метаболом мышей. Все эти направления объединены использованием спектроскопии ЯМР в качестве основного метода получения информации. При использовании методов ЯМР-скрининга, молекулярного моделирования и медицинской химии, а также использовании информации о строении соединений, связывающихся с Mt-PPазой и Sa-ФДГ, найденных на предыдущих этапах проекта, были найдены ингибиторы этих ферментов, имеющие величины IC50, лежащие в области мкМ. Для них определены положения в сайте связывания с ферментами. Проанализирована взаимосвязь структуры найденных соединений с их ингибирующими свойствами. Полученная информация будет использована в дальнейших работах для дизайна более активных производных с наиболее благоприятными физико-химическими характеристиками и профилем ADME свойств. Проведены структурные исследования с помощью методов ЯМР серии новых противогрибковых соединений, сочетающих в своей структуре два фармакофорных фрагмента: оригинального препарата микозидина, разрушающего клеточную стенку грибов, и флуконазола, блокирующего биосинтез эргостерина – важного компонента цитоплазматической мембраны грибов. Первой задачей проекта на данном этапе был отбор наиболее перспективных гибридных молекул. Он был выполнен на основании результатов докинга серии структур в активный сайт 14α-деметилазы цитохрома P450 Candida albicans. Второй задачей проекта было подтверждение структуры синтезированных соединений с помощью спектроскопии ЯМР. В ходе этих исследований было открыто протекание реакции внутримолекулярной циклизации с образованием спироциклического квартенизированного соединения. Биологические испытания на противогрибковую активность в тестах in vitro показали, что присутствие продукта этой перегруппировки повышает биологическую активность исследуемых образцов, что делает найденные структуры перспективными для дальнейших углублённых исследований. Обнаружена ранее не описанная прочная водородная связь между фенильным протоном арилиденового фрагмента и атомом серы тиазолидинового кольца. Методом ЯМР строго доказано существование этой неканонической водородной связи, свидетельствующей о высоких акцепторных свойствах атома серы фрагмента тиазолидин-2,4-диона. Это объясняет протекание ряда необычных перегруппировок в соединениях этого класса, в механизме которых атака на атом серы является ключевой стадией. В отчетный период завершен анализ метаболомных данных по поиску биомаркеров витаминного статуса человека. Проанализированы спектры ЯМР мочи и крови здоровых добровольцев, принимавших витамины A, D, С, E, K, В1, В6, B9 или В12 в дополнение к стандартной диете. Сравнение образцов, полученных до назначения витамина (визит 1), после 2 недель приёма препарата (визит 2) и спустя 2 недели после окончания приёма витамина (визит 3) показало, что в большинстве случаев существенных отличий в метаболомном профиле не наблюдается, что не позволяет использовать тот или иной метаболит в качестве биомаркера витаминного статуса человека. Эффект от приёма витаминов в значительной степени нивелируется индивидуальными особенностями метаболизма, а также неоднородностью диеты добровольцев. Это приводит к сильному различию в содержании метаболитов в биологических жидкостях одной и той же экспериментальной группы. Установлено, что во всех случаях визит 3 отличается гораздо более значимо от визитов 1 и 2. Это свидетельствует об отложенном эффекте приема витаминов. Получены спектральные данные для образцов биологических жидкостей добровольцев, принимавших участие в эксперименте по изучению метаболомного и пищевого статуса лиц с ожирением и поиску метаболических маркеров использования экзогенных кетоновых тел. Обнаружено, что у большинства пациентов, принимавших препараты β-оксибутирата, наблюдается повышение концентрации ацетата в моче. Проведено исследование по определению влияния коэнзима Q10 на кишечную микробиоту и, как следствие, на концентрацию метаболитов в крови и фекалиях крыс. Установлено, что при интрагастральном введении крысам коэнзима Q10 значимо увеличиваются концентрации солей короткоцепочечных карбоновых кислот (валерат, изовалерат, гептаноат, ацетат, бутират, пропионат), некоторых аминокислот (триптофан, изолейцин), а также 3-фенилпропионата и лактата в фекалиях. При этом заметного влияния препарата на концентрацию метаболитов в плазме крови не наблюдается. Полученные данные позволяют предполагать, что наблюдаемые эффекты обусловлены воздействием коэнзима Q10 на кишечную микробиоту. Изучено влияние нокаутирования генов метилтрансфераз Mettl4 и MT на метаболом мышей. Эти гены кодируют метилтрансферазы, отвечающие за метилирование азотистых оснований в малых ядерных РНК, входящих в состав сплайсосомы. Имеются предположения, что мыши, нокаутные по этим генам, могут проявлять фенотип, характерный для диабета II типа. Установлено, что нокаут гена метилтрансферазы Mettl4 существенно изменяет концентрации нескольких метаболитов в биологических жидкостях. В крови существенно повышается концентрация оксипуринола, АТФ, ГТФ, 2-гидроксиизовалерата и еще нескольких метаболитов, но значительно понижается концентрация ацетата. В моче повышается концентрация 2 гидроксиизовалерата, но понижается концентрация креатина, пирувата, 3-гидроксиизобутирата, урацила, ксантозина и еще нескольких метаболитов. Нокаут гена метлитрансферазы MT приводит к полуторакратному понижению концентрации маннозы в крови и к значимому повышению концентраций 2-гидроксиизовалерата, N,N-диметилглицина и метаболита с пока неустановленным строением. В моче трансгенных животных наблюдается снижение концентрации 3-гидроксиизобутирата, урацила, креатина и аскорбата и повышение концентрации 3-индоксилсульфата и формиата. На основе полученных данных готовится материал к статье, посвящённой характеристике трансгенных мышей, нокаутных по генам метилтрансфераз Mettl4 и MT. По материалам проведенных исследований в 2023 году опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах. Одна статья находится на рассмотрении в редакции. Подготовлены рукописи еще трех статей по материалам проведенных в 2023 году исследований. Сделано семь докладов на Российских и международных научных конференциях и научных школах.