КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00115

НазваниеМетоды ЯМР в молекулярной фармакологии и фармакометаболомике

РуководительПольшаков Владимир Иванович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2022 - 2023 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (35)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаСпектроскопия ЯМР, структура и динамика белка в растворе, взаимодействие белок-лиганд, ЯМР скрининг, метаболомика, теломераза, пирофосфатаза, формиатдегидрогеназа, витамины

Код ГРНТИ34.15.63


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Спектроскопия ЯМР является одним из важнейших биофизических методов исследования живых систем. Методы ЯМР в растворе и твердой фазе, наряду с рентгеновской кристаллографией и криоэлектронной микроскопией составляют экспериментальную основу структурной биологии, прогресс которой в последние годы определил стремительное развитие молекулярной биологи, молекулярной фармакологии и других смежных областей науки, исследующих живые системы. Но наибольшую ценность методы ЯМР предоставляют для мониторинга белок-лигандных взаимодействий и изучения сложных смесей низкомолекулярных соединений (например, метаболитов в биологических жидкостях). Настоящий проект нацелен на разработку эффективных подходов к решению этих задач. Планируется поиск новых биологически активных соединений методами ЯМР скрининга, исследование структуры и конформационных свойств новых антибактериальных, противогрибковых и противораковых соединений, и метаболомные исследования, имеющие своей целью, как поиск биомаркеров, характеризующих уровень потребления витаминов человеком, так и определение последствий нокаутирования различных генов у мышей на метаболомном уровне. Основным методом решения всех указанных задач является спектроскопия ЯМР. В ходе исследований, проведенных в рамках проекта за период 2019-2021 гг., методами спектроскопии ЯМР были изучены неорганическая пирофосфатаза из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPаза, 110 кДа) и формиатдегидрогеназа из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ, 84 кДа). Для них получено отнесение сигналов, необходимое для рационального дизайна ингибиторов этих ферментов – потенциальных антибактериальных препаратов. Уже были найдены первые структуры ингибиторов. В рамках развития проекта по этому направлению планируется выполнить работы по дизайну новых, более эффективных ингибиторов этих ферментов. Для соединений – лидеров по ингибирующим свойствам будут определены центры их связывания с белками-мишенями на основе изменений химических сдвигов Mt-PPазы и Sa-ФДГ при их взаимодействии с найденными соединениями и последующего молекулярного моделирования. Ингибирующие свойства найденных соединений – хитов будут определены в соответствующих in vitro биохимических тест-системах. Для найденных ингибиторов обоих ферментов будет проведен анализ взаимосвязи структура-активность. Важным направлением работ по проекту являются исследования в области ЯМР метаболомики. Метаболомный анализ позволяет идентифицировать одновременно больше число метаболитов в исследуемой пробе, создать индивидуальный “метаболический отпечаток”, который характеризует функциональное состояние организма. Для получения достоверных выводов необходим строгий статистический анализ результатов метаболомного эксперимента его сопоставление с базовыми клинико-лабораторными показателями участников исследования. По направлению метаболомных исследований, имеющих своей целью поиск биомаркеров, характеризующих уровень потребления витаминов, будет завершён начатый ранее анализ измеренных спектров ЯМР биологических жидкостей (мочи, сыворотки и плазмы крови) добровольцев, принимавших витамины A, D, С, E, K, В1, В6, и В12. На основе распределения концентраций метаболитов будет выполнен статистический анализ полученных данных. Полученные результаты будут проанализированы совместно с данными иммуноферментного анализа по концентрациям исследуемых витаминов. Предполагается, что удастся идентифицировать метаболиты, концентрация которых достоверно изменяется в зависимости от отсутствия или присутствия каждого из исследованных витаминов. Для витамина В9 (фолиевая кислота) уже удалось идентифицировать β-гидроксибутират в качестве биомаркера приема этого витамина. Планируется методами ЯМР метаболомики провести дополнительные исследования на группе добровольцев до и после приема β-гидроксибутирата и исследовать взаимосвязь между клинико-лабораторными показателями и концентрацией метаболитов у обследованных лиц. Метаболомную часть проекта планируется расширить и на исследование влияния нокаутирования несколько генов у мышей, отвечающих за регуляцию внутриклеточных процессов, на метаболом экспериментальных животных. Планируется исследовать метаболом мышей, нокаутных по генам трех метилтрансфераз (Mettl4, MT и Mettl15) и по гену Mtln, кодирующему пептид - регулятор липидного обмена митохондрий. Сравнение метаболических профилей биологических жидкостей нокаутных животных и мышей дикого типа позволит выявить изменения в метаболизме, которые могут быть ассоциированы с функциональной ролью исследуемых генов. Результаты такой работы имеют очевидную ценность для развития методов системной биологии. Предложенные исследования являются новыми и в своей совокупности не имеют аналогов в мире. Планируется публикация полученных результатов преимущественно в журналах первого квартиля списка Web of Science.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения запланированного исследования методами ЯМР скрининга планируется создать соединения, обладающие ингибирующей активностью по отношению к неорганической пирофосфатазе из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазе) и формиатдегидрогеназе из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ). Эти соединения могут рассматриваться в качестве потенциальных антибактериальных препаратов, механизм действия которых связан с блокированием указанных ферментов патогенных бактерий. Методами ЯМР и молекулярного моделирования будут определены центры связывания этих соединений с белками-мишенями. Методами ЯМР и квантовой химии будет исследовано строение, конформационные и физико-химические свойства новых антибактериальных, противогрибковых и противораковых соединений - синтезированных или выделенных из природных объектов. В результате выполнения исследований в области ЯМР метаболомики будут идентифицированы метаболиты, концентрация которых меняется в зависимости от уровня приема витаминов A, D, С, E, K, В1, В6, B9 и В12. В случае обнаружения статистически достоверных различий в уровне концентрации таких метаболитов в биологических жидкостях добровольцев до и после приема указанных витаминов, они могут рассматриваться в качестве биомаркеров витаминного статуса человека. Такие маркеры могут быть далее использованы для разработки новых методов диагностики витамин-дефицитных состояний человека и их коррекции. В ходе исследования влияния нокаутирования различных генов на метаболом мышей планируется получить информацию о том, как нокаут по генам метилтрансфераз Mettl4, MT и Mettl15, и гену Mtln, кодирующему пептид - регулятор липидного обмена митохондрий, отражается на концентрации метаболитов в биологических жидкостях мышей (мочи и плазмы крови). Полученные данные позволят cделать вывод о возможной функциональной роли продуктов исследованных генов и причинах наблюдаемых изменений на метаболомном уровне. Запланированные результаты соответствуют уровню работ ведущих мировых научных центров и имеют высокую научную значимость. Цели проекта полностью соответствуют направлению Стратегии научно-технологического развития РФ «Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных)». Это относится, как к поиску новых биологически активных соединений, так и к развитию высокотехнологических методов ЯМР метаболомики для решения задач персонализированной медицины. Ожидаемые результаты проекта имеют не только очевидные возможности их практического применения в медицине, но и высокий фундаментальный уровень. Результаты исследования планируется публиковать в ведущих международных высокорейтинговых научных журналах и докладывать на международных и российских конференциях.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году в рамках проекта проводились исследования в области поиска новых биологически активных соединений и исследования метаболома человека и экспериментальных животных. Ключевым экспериментальным методом, используемым для решения всех поставленных задач, была спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Методы ЯМР широко используются на всех этапах создания новых лекарственных препаратов, включая исследование структуры и динамических свойств биомакромолекул-мишеней, отбор соединений-хитов, специфически связывающихся с биомишенью, дизайн соединений, обладающих наибольшей аффинностью по отношению к мишени, контроль структуры синтезируемых соединений-лидеров, доклинические исследования метаболизма найденных соединений, исследования влияния биологически активных препаратов на метаболом человека. Практически все из перечисленных исследований выполнялись в рамках настоящего проекта. Был выполнен поиск соединений, обладающих потенциальной антибактериальной активностью, мишенями действия которых являются бактериальная формиатдегидрогеназа из Staphylococcus aureus (Sa-ФДГ) и неорганическая пирофосфатаза из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPазы). В ходе исследований, проведенных в 2022 году продолжен начатый ранее поиск соединений, способных специфически связываться с этими ферментами и вызывать ингибирование ферментативных реакций. Для Sa-ФДГ найдены молекулярные фрагменты, обеспечивающие взаимодействие соединений с белком в кармане связывания ко-фактора NAD+. Исследованы ингибирующие свойства серии соединений из коммерчески доступных библиотек, а также синтезированы несколько новых потенциальных ингибиторов Sa-ФДГ. Для одного из них обнаружена ингибирующая активность в биохимической тест-системе in vitro. Намечены пути дальнейшего повышения аффинности синтезируемых соединений этого класса. Синтезировано несколько новых потенциальных ингибиторов Mt-PPазы в ряду производных сульфонафталина и α-аминофосфонатов. Изучены их ингибирующие свойства по отношению к Mt-PPазе с помощью биохимической тест-системы, а также сайты связывания с белком с помощью метода SAR-by-NMR. Для расширения возможностей анализа отношения структура-активность в ряду ингибиторов неорганических пирофосфатаз семейства I дополнительно были проведены биоинформатические исследования данного семейства белков. Идентифицированы семейство-специфичные аминокислотные остатки, расположенные преимущественно во внутритримерном интерфейсе. Установлено, что для большинства этих аминокислотных остатков наблюдаются значимые изменения химических сдвигов и ширин линий амидных групп в спектрах 15N,1H TROSY при взаимодействии белка с природными регуляторами ферментативной активности Mt-PPазы. Таким образом, ингибиторы, связывающиеся с ферментом в карманах, сформированных этими остатками, способны селективно подавлять активность Mt-PPазы не меняя существенно ферментативную активность РРаз из других организмов, включая РРазу клеток человека. Проведены исследования в области применения методов спектроскопии ЯМР и квантовой химии для установления строения новых биологически активных соединений, обладающих антибактериальными и противогрибковыми свойствами, которые были синтезированы или выделены из природных объектов коллегами из МГУ и Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе. Установлено строение нового аналога тетраценомицина X (TcmX), выделенного из актиномицетов Amycolatopsis sp. и являющегося изомером TcmX. Это соединение не проявляет антимикробной активности, хотя отличается от активного аналога лишь положением одной метильной группы. Полученный результат важен для понимания механизма действия тетраценомицинов, как ингибиторов биосинтеза белка на бактериальной рибосоме. Методами спектроскопии ЯМР определено строение конъюгата, сочетающего в структуре макролидный антибиотик десмикозин и фрагмент антимикробного пептида онкоцина. Это соединение, обладающее высокой антимикробной активностью, было синтезирован коллегами из Химического факультета МГУ. Ими же были синтезированы нескольких новых конъюгатов хлорамфеникола и берберина. Механизм антимикробного действия хлорамфикола основан на связывании с пептидилтрансферазным центром бактериальной рибосомы, а фармакологическая активность изохинолинового алкалоида берберин обусловлена действием на клеточную мембрану. Новые конъюгаты показали высокую антибактериальную активность при практически полном отсутствие токсического действия на клетки эукариот. Строение новых синтезированных соединений было подтверждено методами 2D спектроскопии ЯМР. Совместно с коллегами из Института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе проведены исследования по поиску новых соединений, обладающих противогрибковыми свойствами в ряду производных тиазолидин-4-она – аналогов оригинального противогрибкового препарата микозидина. При анализе спектров ЯМР серии новых соединений, полученных путем добавления новых функциональных групп к фармакофорному остову микозидина, обнаружено протекание нескольких неожиданных структурных перегруппировок молекул с раскрытием тиазолидинового цикла и образованием новых гетероциклических соединений. Методами ЯМР исследован механизм этих перегруппировок. Несмотря на замену исходного фармакофорного остова для одного из синтезированных соединений обнаружена высокая активность в отношении штамма Candida parapsilosis. Это позволило расширить структурное разнообразие потенциальных противогрибковых средств. По направлению ЯМР-метаболомных исследований отобрана группа из 135 добровольцев для поиска метаболитов, ассоциированных с приемом экзогенных кетоновых тел (β-гидроксибутирата). У всех добровольцев произведен отбор образцов биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови) до и после курса приема β-гидроксибутирата. Для всех собранных образцов выполнена пробоподготовка и измерены спектры ЯМР. В продолжение начатых ранее исследований по поиску биомаркеров витаминного статуса человека, в 2022 году проведён качественный и количественный анализ образцов биологических жидкостей людей, принимавших витамины D, B1, B6, B9 и B12. Этот анализ позволил выявить несколько веществ, которые потенциально могут служить биомаркерами витаминного статуса. Наиболее значимые различия получены для витаминов B9 и витамина D. Приём витамина B9 приводит к повышению концентраций ароматических и некоторых алифатических аминокислот, а также нескольких других веществ в плазме крови. Приём витамина D приводит к изменению концентрации ацетата, бетаина, аланина, ацетона, аргинина и лейцина. Проведены ЯМР-метаболомные исследования на двух группах мышей с нокаутом по гену Mtln и по гену Mettl15, а также для сравнения на мышах дикого типа. Ген Mtln кодирует небольшой (56 а.о.) пептид, участвующий в регуляции липидного обмена митохондрий, а его инактивация приводит к повышенной активности комплексов дыхательной цепи. Ген Mettl15 кодирует одноименную метилтрансферазу Mettl15, участвующую в метилировании рРНК митохондрий и регуляции правильной сборки митохондриальной рибосомы. Нарушение работы митохондрий, отвечающих за энергетический обмен в клетках, может оказывать влияние на внутриклеточные процессы и дисфункцию всего организма в целом. Установлено, что мышей-нокаутов по гену Mtln происходит накопление соединений, подлежащих окислению в цикле трикарбоновых кислот и их предшественников, а также понижение концентрации интермедиатов этого цикла. Полученные данные свидетельствуют об участии Mtln в бета-окислении жирных кислот. Нокаут гена Mettl15 не привел к значимому изменению концентрации основных метаболитов в крови и моче экспериментальных животных, при том, что комплементарные функциональные и биохимические исследования показали, что нокаутные по Mettl15 мыши демонстрировали пониженную мышечную производительность и более низкие уровни белка Cox3, синтезируемого митохондриальными рибосомами в окислительных камбаловидных мышцах.

 

Публикации

1. Аверина О.А., Лаптев И.Г., Емельянова М.А., Пермяков О.А., Марьясина С.С., Никифорова А.И., Манских В.Н., Григорьева О.О., Болихова А.К., Калабин Г.А., Донцова О.А., Сергиев П.В. Mitochondrial rRNA Methylation by Mettl15 Contributes to the Exercise and Learning Capability in Mice International Journal of Molecular Sciences, 23(11), 6056 (год публикации - 2022).

2. Аверина О.А., Пермяков О.А., Емельянова М.А., Григорьева О.О., Гуляев М.В., Павлова О.С., Марьясина С.С., Фролова О.Ю., Куркина М.В., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., ..., Польшаков В.И., Высоких М.Ю., Сергиев П.В. Mitochondrial peptide Mtln contributes to oxidative metabolism in mice Biochimie, in press (published online first) (год публикации - 2022).

3. Левшин И.Б., Симонов А.Ю., Лавренов С.Н., Панов А.А., Грамматикова Н.Е., Александров А.А., Чази Е.С.М.О., Савин Н.А., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Польшаков В.И. Antifungal Thiazolidines: Synthesis and Biological Evaluation of Mycosidine Congeners Pharmaceuticals, 2022, 15, 563 (год публикации - 2022).

4. Хайруллина З.З., Макаров Г.И., Терещенков А.Г., Буев В.С., Лукьянов Д.А., Польшаков В.И., Ташлицкий В.Н., Остерман И.А., Сумбатян Н.В. Конъюгаты десмикозина с фрагментами антимикробного пептида онкоцина: синтез, антибактериальная активность, взаимодействие с рибосомой Биохимия, том 87, вып. 7, с. 897 – 917 (год публикации - 2022).