Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В Проекте-2022 продолжено изучение возможности применения культур клеток высших растений в качестве сырья для создания препаратов, предназначенных для терапии и профилактики нарушений углеводного и липидного обмена. В работе были использованы методы in vitro выращивания культур клеток высших растений, методы определения их основных ростовых и цитологических характеристик, методы качественного и количественного анализа и идентификации вторичных метаболитов (ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС, ТСХ, спектрофотометрия), определения биологической активности. Сопоставление биологического действия препаратов из клеточной биомассы и интактных растений соответствующих видов проводили с использованием модели алиментарного ожирения на животных без исходных нарушений метаболизма и на животных линии C57BL/Ks-db+/+m (генотип a, db+/+m, животные несут рецессивный ген диабета db (8-я группа сцепления, 4-ая хромосома). Также оценивали влияние препаратов на работоспособность при воздействии совокупности факторов (плавательная нагрузка, гипоксия, темпратурный фактор) и влияние на гемостаз. Спектр исследуемых видов был расширен, благодаря получению новых культур Dioscorea nipponica и D. bulbifera. Для семи новых штаммов суспензионных культур клеток женьшеня вьетнамского (P. vietnamensis) изучены ростовые характеристики при выращивании на средах с различным минральным и гормональным составом при различной плотности посадки. Штаммы PV-4 ДНК, PV-4_SH и PV-70_SH, обладающие высокими ростовыми показателями, были выбраны как наиболее перспективные для дальнейших исслдований. Для полученных штаммов характерен широкий спектр синтезируемых тритерпеновых гликозидов. Экстракты биомассы клеток проявляют высокую активность против Esherichia coli и Staphylococcus aureus (МИК 1-2 мг сух.экстракта\мл) и антиоксидантную активность. Параллельно были продолжены работы по оптимизации выращивания штаммов T. terrestris, P. japonicus и D. deltoidea в лабораторных и промышленных барботажных биореакторах при отъемно-доливном режиме и наработка образцов ихбиомассы для исследований биологической активности. Показано, что для суспензионной культуры клеток D. deltoidea в 20 л биореакторах длительное культивирование приводит к изменению соотношения S/R изомеров протодиосцина. Для культуры клеток T. terrestris показано, что тип биореактора и режим культивирования не влияют на синтез фуростаноловых гликозидов в клетках. Чередование в циклах выращивания питательной среды с 2,4-Д и НУК позволило добиться высокого уровня накопления фуростаноловых гликозидов (1,5 – 2,4 % по сухому весу) с при сохранении высокой жизнеспособности культуры и длительности выращивания. Для штамма клеточной культуры Panax ginseng, выращиваемого более 60 лет в лабораторных и промышленных условиях показано сохранение ростовых, цитологических и кариологических характеристик, а также присутствие в биомассе гликозидов (глюкуронидов) олеаноловой кислоты, среди которых превалировал гинзенозид R0 (0,01-0,03% от сухой массы клеток). Изучение биологического действия на моделях in vivo, включая модель алиментарного ожирения, показало сопоставимую степень воздействия экстрактов из биомассы культур клеток и интактных растений соответствующих видов. В частности, прием препаратов из интактных растений и биомассы культуры клеток D. deltoidea приводил к снижению массы тела лабораторных животных при ожирении. На модели алиментарного ожирения методом иммуноферментного анализа (ИФА) также показано, что прием препаратов из интактного растения и культуры клеток диоскореи дельтовидной приводил к снижению содержания инсулина, лептина и с-пептида в крови экспериментальных животных до показателей интактной группы. Действие препаратов было сопоставимо с эффектом препарата сравнения лираглутида. В ходе исследования показателей свертываемости крови, не было зафиксировано негативного влияния исследуемых экстрактов D. deltoidea на функцию гемостаза. Также показано, что экстракты из растений и культуры клеток D. deltoidea не обладают активностью, присущей прямым или непрямым антикоагулянтам. Введение препаратов интактных растений и клеточной биомассы диоскореи дельтовидной в концентрациях до 100 мг/кг повышало устойчивость животных к гипоксии (на 10-15%), но не оказывало значимого влияния при одновременном воздействии двух факторов: плавательной нагрузки и гипоксии. Исследование метаболических профилей лептин-дефицитных животных показало, что препараты на основе растительной биомассы и культур клеток женьшеня настоящего и якорцев стелющихся повышают содержание С-пептида и лептина в крови, но практически не оказывают влияния на содержание адипонектина. При этом препараты из интактных растений и культур клеток были сравнимы по эффективности воздействия. Исключение составил препарат из интактных растений якорцев, чье воздействие существенно превышало таковое для культуры клеток. Таким образом, в результате выполнения работ по Проекту расширен пул используемых видов, оптимизированы условия выращивания для ряда наиболее перспективных культур и изучено содержание в них вторичных метаболитов. Для ряда культур показаны антиоксидантная и антимикробная активности. Наработанные образцы биомассы были использованы для получения фармацевтических субстанций и изучения их биологической активности на моделях in vivo. Показано, что препараты, полученные из культур клеток, в целом не уступают по эффективности препаратам из интактных растений соответствующих видов, а также препарату сравнения.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект-2022 послужит экспериментальным обоснованием для продолжения начатых в Проекте-2019 доклинических испытаний и, при положительном результате, для последующего внедрения в фармацевтическую промышленность новых лекарственных субстанций на основе культур клеток высших растений различных видов (в том числе - Dioscorea spp., Tribulus terrestris, Panax spp.), и разработки на их основе лекарственных средств для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с нарушениями углеводного и жирового обмена (в частности атеросклероза и сахарного диабета(СД). На основании фитохимического скрининга для проведения исследований в коллекции исполнителей проекта были отобраны линии суспензионных культур клеток Panax spp., Dioscorea spp. и T. terrestris. Для работ по аппаратному выращиванию были выбраны барботажные типы аппаратов, наиболее широко используемые при производстве биомассы растительных клеток объемом 20 и 630 л, а также экономичный полупроточный или «отъемно-доливной» режим выращивания. В результате регулярного скрининга методом UPLC-TOF-MS для подтверждения качества получаемой в биореакторах клеточной биомассы, показано сохранение синтеза изопреноидов для штаммов-продуцентов диоскореи дельтовидной, женьшеня японского и якорцев стелющихся. При этом накопление вторичных метаболитов происходило на достаточном высоком уровне, соответствующему контрольным результатам, полученным при стандартном выращивании в колбах на качалке. Необходимо отметить воспроизводимость основных физиологических показателей штаммов-продуцентов при переходе аппаратурному выращиванию. Первичный скрининг методом UPLC-TOF-MS показал присутствие в биомассе суспензионных культур клеток D. Bulbifera, полученных ранее, присутствие стероидных гликозидов протодиосцина и террестрозина J. Сравнение полученных результатов с данными литературы показало, что ростовые показатели полученных культур клеток сопоставимы с показателями культур клеток других видов Dioscorea spp. и перспективны с точки зрения проведения дальнейших работ. В процессе выполнения работ по Проекту для выбора оптимального режима выращивания и наработки образцов исследовали особенности роста и синтеза целевых метаболитов для новых штаммов суспензионных культур клеток P. vietnamensis при выращивании в колбах на качалке и в 20 л биореакторе. Практически для всех исследуемых линий для всех систем культивирования наблюдали высокие показатели жизнеспособности (79-98 %) и показателей роста. С помощью комбинации методов UHPLC-Orbitrap-MS/MS и UPLC-TOF-MS показано, что для линий P. vietnamensis характерен широкий спектр синтезируемых тритерпеновых гликозидов и их малонильных производных, были идентифицированы 13 основных гинзенозидов групп PPD (Rb1, Rb2/Rb3, malonyl-Rb1, malonyl-Rb2/Rb3), OA (Ro, CS-IV) и окотиллола (OCT) (VinaR1), а также их изомеры. Впервые для культуры клеток P. vietnamensis показано присутствие гинзенозида CS-IV. Были продолжены работы по апробации систем экспресс-оценки биологической активности исследуемых штаммов, полученных методами аппаратурного выращивания. Так, на примере D. deltoidea проводили определение антиоксидантной (АО) активности экстрактов из клеточной биомассы, наработанной в биореакторах. с использованием методов ORAC, FRAP, ABTS и DPPH. Штаммы показали умеренную антиоксидантную активность, при этом опытные образцы культуры клеток D. deltoidea являются перспективными источниками АО, нейтрализующих азотосодержащие свободные радикалы. В качестве систем оценки антимикробной активности были проведены работы по определению минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для D. deltoidea по отношению к 7 наиболее распространенным патогенам, в частности Staphylococcus aureus, включая метициллинрезистентный штамм MRSA, Pseudomonas aeruginosa, и Esherichia coli. Наибольшую антимикробную активность экстракты продемонстрировали против Esherichia coli и Staphylococcus aureus ATCC 25923. В рамках Проекта_2022-2023 были продолжены работы по оценке биологического действия биомассы культур клеток лекарственных растений, полученной в биореакторах, на моделях in vivo. Для сравнения использовали извлечения из интактных растений и/или референсные препараты. На модели гемической гипоксии, препараты из культур клеток женьшеня японского и P. vietnamensis не отличалось между собой и от препаратов сравнения и не оказывали достоверного протекторного действия. В модели острой гистотоксической гипоксии экстракты из культур клеток женьшеня японского и вьетнамского увеличивали время жизни лабораторных животных после введения ингибитора тканевого дыхания натрия на уровне положительного действия экстракта корня женьшеня по сравнению с контролем, однако было менее выраженным, чем у референсного препарата сравнения. На модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией, вызываемой длительным пребыванием в герметичном замкнутом пространстве, экстракты культуры клеток женьшеней японского и вьетнамского обладали выраженным антигипоксическим эффектом. Их прием повышал время жизни лабораторных животных при гипоксии на 30-36 %, однако уступая по эффективности референсному препарату. Исследования действия экстрактов на выносливость проводилось в рамках плавательного теста на фоне одновременного воздействия на организм двух неблагоприятных факторов в моделях физ.нагрузка+гипоксия+гипотермия и физ.нагрузка+гипоксия+гипертермия. В результате показано, что экстракты из биомассы культур клеток женьшеня японского и вьетнамского оказывали положительное действие на выносливость животных на фоне одновременного воздействия гипоксии-и-гипотермии и гипоксии-и-гипертермии. При оценке влияния на работоспособность в тесте «сила хвата» после многократного ежедневного перорального введения экстрактов культур клеток женьшеней японского и вьетнамского лептинрезистентным мышам показано, что по ряду тестов положительное воздействие экстрактов из культуры клеток достоверно превышало таковое для экстракта корня интактного растения. Также оценивали влияние экстрактов культур клеток T. terrestris и D. deltoidea в диапазоне доз на выносливость животных в условиях одновременного воздействия нескольких факторов: плавательной нагрузки, гипоксии и высоких или низких температур. Введение препарата из культуры клеток диоскореи дельтовидной повышало показатели выносливости (времени плавания) при гипоксии по сравнению с контролем и было сравнимо с действием экстракта из корневищ и корней интактных растений. При этом культуры клеток T. terrestris оказывали значимый положительный эффект в условиях одновременного воздействия гипоксии и гипертермии, увеличивая выносливость животных на 30-50% по сравнению с контролем. При одновременном воздействии гипоксии и низких температур эффекта не наблюдали. На основании полученных результатов продолжены работы по составлению рекомендаций по изготовлению и использованию фармацевтических субстанций из клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp., полученной биотехнологическим способом, для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека. По результатам работ 2022-2023 г.г. опубликовано 5 статей и подана в редакцию на рассмотрение (журнал Frontiers in Plant Science (Q1), section Plant Biotechnology) 1 статья. Все журналы входят в Web of science Core collection.