КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-15-00125
НазваниеПоиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств
РуководительКарагяур Максим Николаевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-226 - Психиатрия
Ключевые словапсихические заболевания, шизофрения, депрессия, наследственная предрасположенность, рецептор урокиназы, Т-кадгерин, навигационные рецепторы, однонуклеотидные полиморфизмы, редактирование генома, органоиды мозга, морфогенез, диагностика, животные модели, генная терапия
Код ГРНТИ76.03.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Манифестация психических расстройств дебютирует, как правило, внезапно и может приводить как к инвалидизации самого пациента, так и трагическим социальным последствиям (террористические акты, приступы неконтролируемой агрессии, серийные убийства). Поскольку отсутствуют объективные критерии выявления лиц с предрасположенностью к развитию психических заболеваний, то их диагностика складывается преимущественно из вербального отчета пациента (его родственников) и клинической интерпретации данных опроса или приступа психоза. Существуют данные, свидетельствующие о наследуемой предрасположенности к развитию психических и когнитивных нарушений, обусловленной мутациями или полиморфизмами генов, участвующими в процессах морфогенеза головного мозга (навигационные молекулы, нейротрофины и их рецепторы).
Одним из генов, нарушения которого ассоциируются с развитием широкого спектра психических расстройств (аутизм, шизофрения, депрессия), является ген рецептора урокиназы uPAR (PLAUR) - компонента фибринолитической системы крови, но механизм этого эффекта до последнего времени не был установлен. На протяжении 30 лет наша лаборатория под руководством академика РАН В.А. Ткачука на факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова исследует функции урокиназой системы в организме. Нами впервые было обнаружено, что uPAR выполняет функции навигационной молекулы, играет ключевую роль в пролиферации и миграции эндотелиальных и нейральных клеток, а также в формировании, ветвлении и навигации капилляров и аксонов при росте и регенерации сосудов и нервов. uPAR локализуется на лидирующем крае мигрирующей клетки и конусе растущего аксона, способствует локализации внеклеточного протеолиза, опосредованного лигандом урокиназой, определяет внутриклеточную сигнализацию и стимулирует адгезию лидирующего края клетки к межклеточному матриксу, направляя траекторию ее миграции.
В работах, которые были инициированы руководителем предлагаемого Проекта Карагяуром М.Н. на модели травмы нерва in vivo было показано, что экспрессия uPAR является необходимым условием для успешной его регенерации. Мы обнаружили, что блокирование uPAR или его лиганда uPA снижает миграцию нейральных клеток и нарушает нормальную траекторию роста аксонов, в то время, как добавление урокиназы, наоборот, ускоряет их рост. На основании этих данных мы предположили, что ген PLAUR может являться одним из ключевых в процессе формирования мозга, что и подтвердили на in vivo модели. Шмаковой А.А. было обнаружено, что гиперэкспрессия uPAR в мозгу эмбриона мыши (на сроке Е15.5) ускоряет миграцию кортикальных нейронов из субвентрикулярной зоны в сторону кортикальной пластинки и ускоряет формирование коры головного мозга. Логично предположить, что нарушение экспрессии или функции PLAUR приведет к снижению миграторного потенциала нейральных прогениторов, нарушит правильное формирование головного мозга и заложит материальную основу для развития когнитивных, неврологических и психических нарушений.
Близкой по структуре и функции к uPAR молекулой является Т-кадгерин, навигационный рецептор и молекула межклеточной адгезии. Подобно uPAR Т-кадгерин является гликозилфосфатидил (ГФИ)-заякоренным белком, высокоподвижен в мембране клеток и играет важную роль в навигации эндотелиоцитов и нейральных клеток, но, в отличии от uPAR, он опосредует репульсивный эффект навигационных сигналов. Согласно данным литературы, делеции в гене T-кадгерина ассоциированы с развитием заболеваний аутистического спектра, но понимание механизмов возникновения подобного вида расстройств и роли конкретных геномных вариантов отсутствует.
В целом, понимание роли навигационных молекул, в частности uPAR и T-кадгерина, а также классических навигационных рецепторов (Eph, Plx, Nrp, DCC, UNC5), их лигандов (uPA, адипонектина, эфринов, семафоринов и нетринов), нейротрофинов (NGF, BDNF, GDNF) и их рецепторов (trkA, trkB, GFRa1, ret) в процессах морфогенеза, а также знание о конкретных генетических вариантах данных генов, приводящих к неправильной закладке мозга, позволит не только предсказать вероятность развития психических нарушений, но и осуществлять их своевременную профилактику, определять наиболее подходящую терапевтическую стратегию в зависимости от формы заболевания (наследственная или приобретенная), и, что самое главное, разработать эффективные методы пренатального скрининга, этиотропной и патогенетической терапии.
В Проекте впервые планируется изучить распространенность геномных вариантов uPAR, T-кадгерина, их лигандов uPA и адипонектина (ADIPOQ), а также ассоциированного с урокиназной системой тканевого активатора плазминогена tPA и др. генов (BDNF), в российской популяции среди пациентов, страдающих психическими заболеваниями (шизофрения, эндогенная депрессия) с помощью технологий NGS и аллель-специфичной ПЦР. Функциональная значимость результатов генетического скрининга далее будет подтверждена на модели органоидов головного мозга, полученных с помощью технологии индуцированных плюрипотентных клеток (IPSCs) из мононуклеаров периферической крови пациентов с наиболее распространенными геномными вариантами морфогенетических факторов и тяжелыми формами психических расстройств. На таких органоидах будет изучен профиль экспрессии целевых генов, изучены особенности их морфогенеза (скорость роста, количество слоев, клеточный состав) и спонтанной электрической активности (с помощью потенциал-чувствительных красителей); результаты будут сравниваться с результатами, полученными на “контрольных” органоидах с исправленной копией гена.
В завершении Проекта, обнаруженные геномные варианты морфогенетических факторов мозга, обладающие наибольшей распространенностью и выраженным вкладом в развитие психических расстройств, будут воспроизведены на модели морфогенеза мозга мыши (E15.5) путем in utero инъекции соответствующих генетических конструкций в мозг развивающегося эмбриона мыши (для белков с высокой степенью гомологии между человеком и мышью (CDH13, PLAT, ADIPOQ и др.)) или на органоидах мозга, полученных из IPSCs здоровых пациентов, с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9, технологии siRNA или подходов генной терапии/транс-сплайсинга. Эффективность этих инструментов в наших руках была доказана путем подавления или усиления экспрессии широкого спектра генов (среди них PLAUR и CDH13) на разнообразных клеточных линиях человека и мыши: HeLa, 3T3-L1, Neuro2a, первичные культуры фибробластов человека и мезенхимных стволовых клеток мыши и т.д. (Karagyaur, 2018 - 2021).
В ходе данного исследования будет сделан первый шаг в понимании роли морфогенетических факторов мозга и их различных геномных вариантов в развитии психических заболеваний. Согласно имеющимся у нас данным такие исследования будут проведены впервые. Результаты исследования впервые позволят различать врожденные и приобретенные формы психических заболеваний и заложат основу для будущей молекулярно-генетической диагностики представителей российской популяции на предрасположенность к развитию психических заболеваний (пренатальная диагностика, тестирование при получении разрешения на владение гражданским оружием и пр.), а в перспективе и основу для этиотропной и патогенетической терапии плода на ранних этапах развития.
Ожидаемые результаты
Своевременная диагностика психических и когнитивных расстройств является актуальной задачей современной психиатрии, поскольку позволит снизить вероятность возникновения трагических социально значимых последствий (террористические акты, приступы неконтролируемой агрессии, серийные убийства). Множество генеалогических и генетических исследований свидетельствуют в пользу наличия наследственных форм психических заболеваний, по-видимому, обусловленных нарушением процессов формирования структур головного мозга в ходе эмбриогенеза. Предположительно, такие формы психических и когнитивных нарушений характеризуются ранней манифестацией, быстрым прогрессированием, тяжелым течением и устойчивостью к терапии. Генетическая природа таких нарушений предполагает, что они могут быть диагностированы еще на доклиническом этапе (пренатальный скрининг, при трудоустройстве на объекты социального значения и на опасные производства, получение разрешение на владение оружием и т.п.), а своевременная психологическая и фармакологическая профилактика предположительно позволят отсрочить или предотвратить манифестацию психического заболевания.
Разработка подходов для генетической диагностики (генетические тест-системы) и оценке предрасположенности к развитию психических и когнитивных нарушений позволит осуществлять дифференциацию наследственных и приобретенных форм психических заболеваний, что позволит разработать более адекватные селективные терапевтические подходы для каждой из форм психического заболевания. Понимание значимого вклада наследственных факторов в развитие психических заболеваний, а также отсутствие объективных методов диагностики, дифференциальной диагностики, эффективных методов профилактики, этиотропной и патогенетической терапии (при достаточно высоком уровне распространенности психических нарушений в российской популяции) подталкивают к необходимости поиска и идентификации этих факторов и их патологических вариантов.
Проект предусматривает масштабные исследования, в ходе которых впервые будет изучена степень ассоциации полиморфизмов генов PLAUR, PLAU, PLAT, CDH13, ADIPOQ и др. со временем манифестации и тяжестью течения неврологических и психических заболеваний на примере параноидной шизофрении (непрерывный и эпизодический тип) и эндогенной депрессии, в том числе будут установлены полиморфизмы этих генов, характерные для российской популяции. Важный вклад этих факторов в развитие головного мозга и возникновение психических заболеваний подтверждается нашими собственными результатами и данными литературы.
На органотипических (ex vivo органоиды мозга человека) и животных моделях (in vivo модель развития головного мозга мыши) будут изучены функциональная значимость и степень влияния наиболее распространенных и клинически значимых геномных вариантов исследуемых генов на процессы морфогенеза мозга и развитие психических заболеваний. Идентификация таких вариантов и установление механизмов их влияния на формирование мозга в перспективе может быть использовано для разработки подходов к пренатальной диагностике психических и когнитивных расстройств (создание генетических тест-систем), подходов к пренатальной/постнатальной этиотропной и патогенетической терапии (генная терапия, терапия некодирующими РНК) с целью нормализации процессов морфогенеза мозга и профилактики развития неврологических, когнитивных и психических расстройств.
Своевременная диагностика и профилактика психических нарушений, а также разработка подходов к этиотропной и патогенетической терапии будут способствовать реализации Федеральных Программ по здоровьесбережению и продлению жизни населения РФ, а также приведет к снижению расходов на лечение и социальные выплаты лицам, страдающим психическими заболеваниями, и позволит увеличить эффективность экономики РФ.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Разработан пакет документов для проведения прикладного научного исследования, включающий протокол исследования, информационный листок пациента с формой информированного согласия, индивидуальную регистрационную карту, журналы регистрации биообразцов, соответствующие требованиям нормативной документации по международным стандартам GCP. Пакет документов для проведения данного исследования был рассмотрен и одобрен на заседании Межвузовского Комитета по Этике ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (председатель Вольская Е.А.) 16.12.2021.
Была собрана коллекция ядросодержащих клеток и сыворотки крови пациентов с диагнозом параноидная шизофрения (102 образца) и эндогенная депрессия (42 образца), а также здоровых доноров (105 образцов). Критериями включения пациентов с психическими заболеваниями были: продолжительность заболевания - не менее 4 лет, резистентность к лечению, отягощенный психиатрический семейный анамнез. В ходе исследования возникли сложности с набором образцов от пациентов с эндогенной депрессией, однако, это не помешало выполнить все запланированные на первый год исследования. Недостающее количество образцов будет собрано в течение следующего года.
Образцы ДНК из ядросодержащих клеток крови выделяли набором QiAamp DNA Blood Mini Kit. После оценки качества и количества геномной ДНК образцы были переданы в ООО «Геноаналитика» для проведения полноэкзомного секвенирования. Полученные результаты были обработаны с помощью стандартных биоинформатических подходов: PRINSEQ, Bowtie2 и GATK. Выравнивание полученных данных для генов, ассоциированных с морфогенезом головного мозга (всего 121 ген, PLAUR, ADIPOR1, CDH1, CDH2, CDH3, CDH4, CDH5, CDH6, CDH7, CDH8, CDH9, CDH10, CDH11, CDH12, CDH13, CDH14, CDH15, CDH16, CDH17, CDH18, CDH19, CDH20, CDH21, CDH22, CDH23, CDH24, CDH25, CDH26, CDH27, CDHR1, CDHR2, CDHR3, CDHR4, CD44, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, NRP1, NRP2, UNC5A, UNC5B, UNC5C, UNC5D, UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3, UNC5H4, UNC5H5, DCC, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, PLAU, ADIPOQ, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A, NTN1, NTN3, NTN4, NTNG1, NTNG2, EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3, NGF, BDNF, NTF3, GDNF, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, NTRK1, NTRK2, NTRK3, GFRa1, GFRa3, RET, PLAT, PLG), осуществляли на референсный геном человека GRCh38.p13. Было идентифицировано 233 геномных варианта, приводящих к аминокислотным заменам (миссенс-мутации), 154 из которых приводили к изменению полярности или заряда аминокислот в составе указанных белков.
Было отобрано 16 геномных вариантов для последующего скрининга: BDNF (rs6265), CDH2 (rs17445840, rs1944294), CDH3 (rs12923655, rs3114409), CDH13 (rs4782724), CDH23 (rs10999947, rs1227051), CDH19/DCHS1 (rs4758443), CDH27/DCHS2 (rs1352714, rs12500437, rs11935573, rs28561984, rs72731014), PLAU (rs2227564), PLAUR (rs4760). Для каждого из выбранных геномных вариантов был произведен дизайн праймеров для проведения скрининга методом T-plex ПЦР в реальном времени [Baris et al., Analytical Biochemistry, 2013]. Был произведен подбор оптимальных концентраций и температур отжига праймеров, а также установлена точность и воспроизводимость предлагаемой методики. Полученные данные позволяют утверждать, что предлагаемые наборы праймеров могут быть использованы в качестве основы для разработки тест-систем для скринингового определения указанных геномных вариантов. Данным методом было проанализировано 16 указанных выше геномных варианта для 48% образцов от пациентов с параноидной шизофренией, 38% образцов от пациентов с эндогенной депрессией и 42% образцов от здоровых доноров. Успешно подобранный метод скрининга позволил проанализировать в 1.5 раза больше образцов, чем было заявлено в плане на 1-й год.
Было установлено выраженное различие по представленности геномных вариантов rs12500437 и rs28561984 (ген CDH27/DCHS2). Так, для rs12500437 распространенность в выборках «шизофрения», «эндогенная депрессия» и «здоровые доноры» составила 71.4%, 89.5% и 34%, соответственно. Для rs28561984 распространенность в выборках «шизофрения», «эндогенная депрессия» и «здоровые доноры» составила 30.6%, 34.2% и 2.2%, соответственно. Согласно данным литературы, ген CDH27/DCHS2 ответственен за формирование лица, а мутации в нем ассоциированы с развитием т.н. цереброфациоартикулярного синдрома, характеризующегося, в том числе, дистопией серого вещества головного мозга и задержкой нервно-психического развития. По другим геномным вариантам достоверных различий на представленных выборках установлено не было.
Проведен анализ общедоступных данных single-cell RNA-seq головного мозга человека, охватывающих ранние стадии эмбрионального развития - Carnegie stages (CS) 12-22 (30-56 дни эмбрионального развития) [Eze et al., Nat Neurosci, 2021]. Были проанализировали гены CDH2, CDH13, CDH19/DCHS1, CDH27/DCHS2, PLAU, PLAUR и др. (всего 33 гена) по каждой CS. Самый высокий уровень экспрессии наблюдался для нейрального кадгерина CDH2, который присутствовал во всех CS с максимальной экспрессией в CS19-22. Самая высокая экспрессия гена PLAU наблюдалась при CS14, тогда как экспрессия его рецептора PLAUR достигала максимума при CS22. Кадегрин-19 CDH19/DCHS1 экспрессировался на всех стадиях, а экспрессия кадгерина-27 CDH27/DCHS2 обнаруживалась только на более поздних стадиях развития на очень низком уровне. Полученные данные свидетельствует о важности названных генов (в особенности, CDH2, CDH13, CDH19/DCHS1, CDH27/DCHS2, PLAU и PLAUR) в процессах нейрогенеза и формировании мозга. Эти гены и их геномные варианты рассматриваются в качестве возможных кандидатов для изучения их функциональной роли в развитии мозга на органотипической и животной моделях на 2 и 3 годах выполнения Проекта.
Были созданы лентивирусные плазмидные конструкции, для тетрациклин/доксициклин индуцируемого получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с целью установления функциональной значимости отдельных геномных вариантов. Система состоит из двух векторов: первый обеспечивает экспрессию тетрациклинового трансактиватора (rtTA) под контролем конститутивного эукариотического промотора, а второй кодирует факторы плюрипотентности человека (Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc) под контролем промотора, связывающего rtTA и активирующегося тетрациклином/доксициклином. Функциональная активность полученных векторов будет оценена на следюущем этапе выполнения Проекта.
Была проведена оценка эффективности и специфичности методики транс-сплайсинга для моделирования геномных вариантов целевых генов. В качестве модельного объекта для оценки эффективности технологии транс-сплайсинга была выбрана модель прижизненного мечения внутриклеточного белка цитоскелета гладкомышечного актина - альфа (aSMA), индукция экспрессии которого запускается добавлением TGFb и служит одним из маркеров миофибробластной (профибротической) дифференцировки фибробластов (первично выделенные фибробласты человека).
Фибробласты, трансдуцированные генетической конструкцией, кодирующей соответствующую пре-транс-РНК, усиливали экспрессию зеленого флуоресцентного белка GFP в ~ 10 раз в ответ на индукцию TGFb, причем образующийся слитой белок aSMA-GFP, формировал фибриллоподобные структуры, узнаваемые антителами к aSMA. Результаты ПЦР не позволили подтвердить высокую эффективность транс-сплайсинга, поэтому была проведена дополнительная оптимизация генетических конструкций, кодирующих пре-транс-РНК, и влияние этой оптимизации на эффективность и специфичность транс-сплайсинга будет установлено на следующем этапе выполнения Проекта.
Подготовлены к печати и отправлены в журналы 3 обзорные публикации и 3 тезиса. Набирается материал для публикаций на 2 год (1 обзорная и 3 экспериментальные статьи).
Публикации
1. Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Роль урокиназы, Т-кадгерина и адипонектина в развитии шизофрении, биполярного расстройства и болезни Альцгеймера Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии, - (год публикации - 2022)
2. Шелег Д.А., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Нейфельд Е.А. Роль урокиназы, Т-кадгенрина и адипонектина в развитии эндогенных депрессивных расстройств Уральский Медицинский Журнал, - (год публикации - 2023)
3. Шмакова А.А., Семина Е.В., Нейфельд Е.А., Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н. Анализ взаимосвязи генетических факторов с риском развития шизофрении Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, - (год публикации - 2023)
4. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Нейфельд Е.А., Семина Е.В., Климович П.С., Скрябина М.Н., Самоходская Л.М., Попов В.С., Джауари С.С., Шелег Д.А., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А. Поиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств Гены и Клетки - Материалы V Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 23–25 ноября 2022 года, 17, стр. 101 (год публикации - 2022)
5. Карагяур М.Н., Скрябина М.Н., Басалова А.А., Примак А.Л., Толстолужинская А.Е., Илларионова М.Е., Тюрин-Кузьмин П.А., Ефименко А.Ю. Клеточные модели в медицине: опыт создания и перспективы Цитология, 7,64, 623-624 (год публикации - 2022)
6. Примак А.Л., Басалова Н.А., Скрябина М.Н., Толстолужинская А.Е., Ефименко А.Ю., Карагяур М.Н. Адаптация технологии транс-сплайсинга для создания клеточных моделей Гены и Клетки - Материалы V Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 23–25 ноября 2022 года, 17, стр.192 (год публикации - 2022)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. В отчётный период (2-й год) в группу исследования «эндогенная депрессия» было дополнительно набрано 37 образцов венозной крови, что позволило увеличить общий объем выборки исследования в данной группе до 79 человек. Было завершено скрининговое исследование по выявлению распространенности выбранных геномных вариантов BDNF (rs6265), CDH2 (rs17445840, rs1944294), CDH3 (rs12923655, rs3114409), CDH13 (rs4782724), CDH23 (rs10999947, rs1227051), CDH19/DCHS1 (rs4758443), CDH27/DCHS2 (rs1352714, rs12500437, rs11935573, rs28561984, rs72731014), PLAU (rs2227564) и PLAUR (rs4760) в группах «шизофрения» (n=102), «эндогенная депрессия» (n=79) и «здоровые доноры» (n=103).
Был выявлен ряд достоверных различий в распространенности отдельных геномных вариантов между экспериментальными и контрольной группами. Так, в группе «шизофрения» была установлена достоверно более высокая встречаемость геномных вариантов rs1944294-T в гене CDH2 (p = 0.0443, n = 102) и rs11935573-G в гене DCHS2 (p = 0.0009, n = 102) по сравнению с группой здоровых добровольцев. Помимо этого, в группе пациентов, страдающих шизофренией, наблюдается более частая встречаемость аллеля rs12500437-G в гене DCHS2 (p = 0.034, n = 102) по сравнению с группой здоровых добровольцев.
В группе пациентов, страдающих эндогенной депрессией, была установлена достоверно более высокая встречаемость геномного варианта rs17445840-T в гене CDH2 (p = 0.0315, n = 79) по сравнению с группой здоровых добровольцев. Помимо этого, в группе таких пациентов была обнаружена достоверно повышенная частота встречаемости гетерозиготных вариантов rs1227051-G/A в гене CDH23 (p = 0.0014, n = 79) и rs12500437-G/T в гене DCHS2 (p = 0.0390, n = 79). Частота встречаемости гетерозиготного варианта rs12923655-A/C в гене CDH3 в данной выборке, напротив, была снижена - с преобладанием частот встречаемости гомозиготных вариантов rs12923655-A или rs12923655-C (p = 0.0360, n = 79).
Было проведено сравнение полученных результатов с опубликованными данными полноэкзомных исследований для нероссийских популяций. Для абсолютного большинства изученных геномных вариантов (кроме, BDNF (rs6265) и PLAU (rs2227564)) в контексте их возможного участия в развитии предрасположенности к возникновению психических и когнитивных нарушений, никакой информации в базах данных SZGene database, SZGR2, SZDB 2.0, SNPedia, SNP Curator и Pubmed обнаружено не было.
Сравнение частот встречаемости геномных вариантов BDNF (rs6265) и PLAU (rs2227564), описанных для нероссийских популяций, между различными популяциями было затруднено ввиду их высокой вариабельности. Результаты для BDNF (rs6265), полученные в нашем исследовании, в наибольшей степени согласуются с результатами, полученными ранее коллегами [Morozova A et al, 2021] в российской популяции.
Для моделирования на тканевых моделях (нейроглиальные сфероиды) были предложены геномные варианты, по которым было выявленное достоверное различие при скрининговом исследовании - DCHS2 (rs11935573); которые были идентифицированы при полноэкзомном секвенировании ограниченных выборок образцов геномной ДНК пациентов, страдающих шизофренией и депрессией - EPHA1 (rs11768549), NGF (rs138175552), PLXNA3 (rs139336954); выбраны на основании данных литературы - CDH13 (rs736719) и PLAU (rs1243306395). Для моделирования у мышей были предложены геномные варианты rs11935573 (ген DCHS2), rs139336954 (ген PLXNA3) и rs1243306395 (ген PLAU), поскольку гены мыши Dchs2, Plxna3 и Plau содержат высокогомологичные последовательности.
2. Была оценена эффективность технологии транс-сплайсинга для моделирования искомых геномных вариантов, в том числе при использовании оптимизированной донорной транс-РНК. Применение технологии транс-РНК (даже с учетом применения оптимизированной донорной транс-РНК в вариантах с или без NRS) не привело к увеличению количества транс-сплайсированной модифицированной мРНК (не была идентифицирована в ходе сравнительного транскриптомного анализа) и не привело к искомой генетической модификации клеточных линий: не наблюдали формирования GFP-меченых стресс-фибрилл (aSMA) в культуре первично выделенных фибробластов и не наблюдали нарушения роста нейритов (Plaur) в культуре Neuro 2a.
Для моделирования искомых геномных вариантов была опробована модификация технологии редактирования генома CRISPR-BE [Gaudelli et al, 2017], а в качестве мишени был выбран ген Plaur в культуре Neuro2a. Эффективность редактирования с использованием редакторов оснований была подтверждена путем секвенирования целевого гена и проточной цитометрией Neuro2a, окрашенных антителами, специфичными к mPlaur и меченых PE (#MBS632008, MyBioSource) - уровень экспрессии целевого белка снизился на ~85 %. Данная система была использована для моделирования интересующих геномных вариантов в генах морфогенеза мозговой ткани. Были подобраны и встроены направляющие РНК для моделирования вариантов генов CDH13, DCHS2, EPHA1, NGF, PLAU и PLXNA3.
3. На основе векторов Lenti-tetO-Oct4-t2A-Klf4-p2A-c-Myc-e2A-Sox2 и Lenti-UbcPr-rtTA собирали лентивирусные частицы, которыми трансдуцировали мононуклеары периферической крови здорового донора. Индукция дедифференцировки доксициклином 100 нг/мл в течение 28 суток позволила добиться стабильно высокого уровня продукции мРНК факторов плюрипотентности в 30-80 раз, что привело к дедифференцировке мононуклеаров и получению культуры иПСК. Плюрипотентный статус иПСК был подтверждён в модели формирования подкожной тератомы у мышей линии Nude. Было установлено, что иПСК, введенные подкожно в GFR Matrigel® образуют в месте введения ограниченное образование, окруженное соединительнотканной оболочной и содержащее клетки мезодермального (жировая и рыхлая соединительная ткани) и эктодермального (предположительно, железы) происхождения. Полученные иПСК были использованы для получения нейральных прогениторных клеток и сборки нейроглиальных сфероидов с целью установления роли отдельных геномных вариантов в процессах морфогенеза мозговой ткани.
4. Было собрано 3 генетически кодируемых сенсора: Lenti-GAD2pr-Case12, Lenti-THpr-Archon1 и Lenti-MAGpr-YFP, на основе которых были собраны лентивирусные частицы (ЛВЧ), которыми в свою очередь были трансдуцированы нейральные прогениторные клетки, которые затем использовали для сборки нейроглиальных сфероидов.
Было установлено, что генетически кодируемые сенсоры экспрессируются, что позволяет одновременно визуализировать и идентифицировать несколько клеточных типов в рамках одного сфероида. Для потенциал-чувствительных сенсоров GAD2pr-Case12 и THpr-Archon1 была продемонстрирована способность изменять яркость флуоресценции в зависимости от потенциала клеточной мембраны при добавлении к нейроглиальным сфероидам 10 мкМ норадреналина. Факт нейральной дифференцировки в нейроглиальном сфероиде был подтвержден с помощью иммуногистохимического окрашивания их криосрезов с помощью антител к маркерам нейронов (NSE, TH) и глиальных клеток (GFAP). Окрашивание криосрезов сфероидов неиммунными кроличьими IgG практически не давало сигнала.
Для моделирования исследуемых генетических вариантов: DCHS2 (rs11935573), EPHA1 (rs11768549), NGF (rs138175552), PLXNA3 (rs139336954), PLAU (rs1243306395) и CDH13 (rs736719) были созданы лентивирусные генетические конструкции, кодирующие соответствующие направляющие РНК. В настоящий момент осуществляется анализ эффективности геномного редактирования в отдельных клонах иПСК, на основании которого будут отобраны клоны, содержащие исследуемые геномные варианты, для получения изогенных нейроглиальных сфероидов.
5. Была отработана методика получения оплодотворенных яйцеклеток и методика эмбриотрансфера эмбрионов после геномного редактирования псевдобеременным самкам. Процедуру введения эмбрионов в воронку яйцевода мыши контролировали путем введения пищевого красителя в яйцевод с помощью капилляра.
6. По результатам выполнения работ написано 4 публикации: 3 экспериментальные (2 приняты к печати и 1 на этапе рецензирования) и 1 обзорная (подача в журнал).
Публикации
1. Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Идентификация геномных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани, ассоциированных с развитием параноидной шизофрении в российской популяции Сибирский вестник психиатрии и наркологии, - (год публикации - 2024)
2. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Бозов К.Д., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Ассоциация встречаемости однонуклеотидных геномных вариантов в генах морфогенеза головного мозга с предрасположенностью к эндогенной депрессии в российской популяции Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии, - (год публикации - 2024)