Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Пластичность головного мозга базируется на нескольких взаимосвязанных механизмах (синаптическая передача, нейритогенез и синаптогенез, элиминация синапсов, нейрон-глиальные взаимодействия, нейрогенез, изменения микроциркуляции и ремоделирование церебральных микрососудов). Интерес вызывает изучение вклада церебрального неоангиогенеза и регрессии микрососудов головного мозга в пластичность головного мозга при обучении и запоминании, роли клеток церебрального эндотелия и состава микроокружения в ангиогенезе и барьерогенезе, механизмов сопряжения нейрогенеза и неоангиогенеза в нейрогенных нишах головного мозга, особенностей реализации этих механизмов на разных этапах прогрессирования хронической нейродегенерации. Это актуально с учетом важности разработки новых подходов к предупреждению и патогенетической терапии хронической нейродегенерации. Многие из перечисленных механизмов могут быть корректно изучены не только в моделях in vivo, но и in vitro, поэтому актуальной является разработка новых in vitro моделей нейроваскулярной единицы (НВЕ)/гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), воспроизводящих ключевые события, характерные для аберрантной нейропластичности. В фокусе первого этапа проекта – изучение особенностей повреждения клеток нейрональной и эндотелиальной природы в ткани головного мозга экспериментальных животных с моделью нейродегенерации альцгеймеровского типа, оценка особенностей нейрогенеза, ангиогенеза и барьерогенеза в модельных системах in vivo и in vitro, разработка и сборка клеточных моделей НВЕ/ГЭБ для изучения механизмов аберрантного ангиогенеза/барьерогенеза при нейродегенерации. Для решения поставленных задач были применены: а) методы моделирования нейродегенерации альцгеймеровского типа на экспериментальных животных (интрагиппокампальное введение бета-амилоида 25-35); б) оценка когнитивной функции животных (условно-рефлекторное пассивное избегание) в течение 4 недель после предъявления обучающего стимула; в) комплексное иммуногистохимическое исследование экспрессионного профиля клеток нейрональной, астроглиальной, эндотелиальной природы, клеток нейрогенных ниш разной степени дифференцировки, клеток-участников ангиогенеза, а также маркеров митохондриальной динамики, аутофагии нейронов и эндотелиоцитов, пролиферации и апоптоза клеток в динамике прогрессирования нейродегенерации; г) получение первичных культур клеток-компонентов нейроваскулярной единицы/гематоэнцефалического барьера, их иммунофенотипирование и сборка многокомпонентных моделей in vitro в статическом и динамическом вариантах; д) комплексная оценка проницаемости формируемого in vitro гематоэнцефалического барьера с применением маркерного красителя, оценкой экспрессии белков плотных контактов и регистрацией трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER); е) оценка влияния бета-амилоида 25-35 на основные параметры проницаемости барьера и митохондриальной активности клеток церебрального эндотелия in vitro; ж) оценка ангиогенеза с использованием первичной культуры клеток эндотелия церебральных микрососудов в 3D модели, в том числе при действии бета-амилоида 25-35. На первом этапе получены новые фундаментальные данные о механизмах повреждения клеток нейрональной и эндотелиальной природы, нарушений процессов нейрогенеза и ремоделирования микрососудистой сети в четырех регионах головного мозга, вовлеченных в процессы обучения и запоминания, у экспериментальных животных с моделью нейродегенерации альцгеймеровского типа (субгранулярная зона гиппокампа, сувентрикулярная зона, энторинальная кора, префронтальная кора); разработаны и протестированы оригинальные двух- и трехкомпонентные модели нейроваскулярной единицы/гематоэнцефалического барьера (НВЕ/ГЭБ), пригодные для воспроизведения и изучения механизмов нарушения структурно-функциональной целостности барьера, ангиогенеза и барьерогенеза. Установлено, что тенденция к появлению когнитивной дисфункции у экспериментальных животных регистрируется к 24 суткам после интрагиппокампального введения бета-амилоида 25-35, а статистически значимый характер эти изменения достигают к 38 суткам наблюдения (4 неделя после действия обучающего стимула). Впервые установлено, что процессы нейрогенеза и ангиогенеза имеют различные характеристики в периоде, предшествующем формированию когнитивной дисфункции у животных, и на фоне появления признаков когнитивного дефицита у экспериментальных животных. Продемонстрировано, что у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера индукция нейрогенеза в нейрогенных нишах сохранена и даже, по некоторым позициям, носит более выраженный характер, чем у животных контрольной группы, что, вероятно, является следствием предсуществующей стимуляции репаративного нейрогенеза в ответ на повреждение клеток бета-амилоидом. Показано, что до проявления когнитивной дисфункции в субгранулярной зоне гиппокампа интенсификация репаративного и опыт-индуцированного нейрогенеза происходит на фоне транзиторной стимуляции ангиогенеза, с последующими нарастающими явлениями эндотелиальной дисфункции, аутофагии эндотелиоцитов и регрессии сосудов, а в другой нейрогенной нише – субвентрикулярной зоне - явления ангиогенеза/ремоделирования микрососудов выражены на протяжении всего периода наблюдения, при этом локально присутствует значительное число пост-митотических нейронов, экспрессирующих Arg3.1/Arc. В префронтальной и энторинальной коре в течение всего периода наблюдения зарегистрированы нарушения митохондриальной динамики в нейронах и клетках церебрального эндотелия, развитие астроглиоза, при этом в энторинальной коре в периоде манифестации когнитивной дисфункции регистрируется усиленная аутофагия клеток церебрального эндотелия, свидетельствующая о ремоделировании микрососудов. В созданной оригинальной статической модели ГЭБ in vitro установлено, что церебральные эндотелиоциты (в присутствии астроцитов) формируют полноценный барьер с лимитированной проницаемостью, барьерная функция эндотелия и астроглии усиливается при дополнении модели ламинином как компонентом базальной мембраны ГЭБ. Показано, что в присутствии бета-амилоида 25-35 клетки эндотелия демонстрируют сниженный мембранный потенциал митохондрий и пониженную активность НАДН-дегидрогеназ. В созданной оригинальной 2D динамической модели ГЭБ установлено, что церебральные эндотелиоциты демонстрируют чувствительность к токсическому действию Aβ. В 3D модели ангиогенеза с использованием матригеля продемонстрировано, что церебральные эндотелиоциты имеют ангиогенный потенциал, усиливаемый действием бета-амилоида 25-35 in vitro. Полученные результаты демонстрируют, что: а) процессы ангиогенеза и ремоделирования сосудов, ассоциированные с прогрессированием повреждения клеток нейрональной и эндотелиальной природы, имеют разную направленность в период до манифестации и в период проявления когнитивного дефицита при экспериментальной БА; б) в нейрогенных нишах головного мозга указанные события ассоциированы с изменением механизмов нейрогенеза; в) экспрессия молекул, формирующих локальное проангиогенное микроокружение, меняется в ткани головного мозга при опыт-индуцированной пластичности и при нейродегенерации; г) в in vitro моделях НВЕ/ГЭБ регистрируются события, индуцированные токсическим действием бета-амилоида в отношении клеток церебрального эндотелия, приводящие к нарушению целостности барьера и механизмов ангиогенеза. Результаты создают основу для реализации следующего этапа проекта по детализации механизмов развития аберрантного ангиогенеза/барьерогенеза при болезни Альцгеймера. На первом этапе работы опубликованы 3 (с учетом квартиля Q1 – 4) статьи в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science/Scopus. Результаты представлены (устные доклады) на 2 конференциях (международной и всероссийской).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Церебральный ангиогенез/барьерогенез – неотъемлемый компонент механизмов пластичности мозга, реализуемый в пределах нейроваскулярной единицы (НВЕ) и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), и характеризующийся значимыми изменениями при нейродегенерации. Управление ангиогенезом может быть актуальным в редуцировании неврологического дефицита, однако данные о влиянии антиангиогенных препаратов на когнитивный статус противоречивы, а малая изученность клеточно-молекулярных механизмов этих событий и ограниченность доступных клеточных моделей для их анализа существенно ограничивает разработку эффективных терапевтических протоколов, в том числе при болезни Альцгеймера (БА). В развитие результатов, полученных при выполнении первого этапа работы (формирование когнитивного дефицита на фоне аберрантного нейрогенеза и ангиогенеза в нейрогенных нишах (субгранулярная зона гиппокампа, SGZ, субвентрикулярная зона, SVZ), ремоделирование сосудов в префронтальной и энторинальной коре, нарушение митохондриальной динамики и аутофагии нейрональных и эндотелиальных клеток в разные периоды формирования и манифестации когнитивной дисфункции in vivo; повреждение митохондрий, подавление ангиогенной активности клеток церебрального эндотелия и нарушение структурной целостности ГЭБ при токсическом действии бета-амилоида in vitro), на втором этапе мы сфокусировались на поиске ответов на следующие вопросы: а) каков вклад ремоделирования микрососудов нейрогенных ниш в поддержание нейрогенеза и обеспечение условий для нейропластичности в норме, так и при развитии нейродегенерации альцгеймеровского типа; б) каково состояние сосудистой сети головного мозга в динамике формирования когнитивного дефицита при нейродегенерации; в) является ли стимуляция ангиогенеза в нейрогенных зонах головного мозга механизмом компенсации при развитии хронической нейродегенерации; г) каковы субпопуляционные изменения в церебральном эндотелии (соотношение количества tip-клеток, stalk-клеток, phalanx-клеток) и насколько значим васкулярный компонент патогенеза БА при опыт-индуцированной и адаптивной пластичности в норме и при нейродегенерации; д) как активность нейронов влияет на состояние клеток эндотелия при действии на них бета-амилоида in vitro; е) какие протоколы могут быть использованы для создания персонифицированных моделей ГЭБ in vitro. Для решения поставленных задач на втором этапе мы использовали две модели БА на экспериментальных животных (мышах) (интрагиппокампальное введение бета-амилоида, трансгенная модель 5xFAD); анализ когнитивных функций после обучения животных (тест УРПИ), оценка нейрогенеза и неоангиогенеза с использованием протокола включения BrdU в пролиферирующие клетки, оценка проницаемости ГЭБ, ветвления и плотности сосудистой сети в четырех зонах головного мозга, иммуногистохимическая оценка экспрессии маркеров клеток-компонентов НВЕ/ГЭБ, маркеров разных субпопуляций клеток эндотелия (tip-, stalk-, phalanx-клетки), зрелых CLDN+ клеток эндотелия, GPR81 рецепторов лактата в четырех регионах головного мозга в динамике после обучения (1, 7, 28 сутки), иммуноблоттинг для оценки продукции BDNF, VEGF в ткани головного мозга, введение ингибитора ангиогенеза TNP-470 и оценка его влияния на когнитивный статус животных и экспрессионный профиль клеток эндотелия; протоколы получения первичных культур клеток-компонентов НВЕ/ГЭБ из головного мозга экспериментальных животных с их иммунофенотипированием, анализом экспрессионного профиля, выживаемости при действии бета-амилоида in vitro, реконструкция модели НВЕ/ГЭБ в transwell-формате и на микрофлюидном чипе с оценкой проницаемости барьера, апоптоза клеток, экспрессионного профиля, продукции VEGF (иммуноферментный анализ) и лактата (спектрофотометрия) при действии бета-амилоида и глутамата; дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в клетки-компоненты ГЭБ in vitro с оценкой их морфологии и иммунофенотипированием. Установлено, что, как и в модели БА с интрагиппокампальным введением Aβ, так и у трансгенных животных линии 5xFAD, демонстрирующих прогрессирующую нейродегенерацию с самых ранних этапов онтогенеза, регистрируется схожая динамика манифестации когнитивной дисфункции. Впервые показано, что при опыт-индуцированной пластичности в норме в четырех исследованных зонах мозга изменяется соотношение tip- и stalk-клеток эндотелия, при этом в SGZ гиппокампа и в префронтальной коре к 28 суткам после обучения реализуется феномен латерального ингибирования. У животных с интрагиппокампальным введением Аβ опыт-индуцированная пластичность сопровождается несбалансированной интенсификацией нейрогенеза и ангиогенеза, с признаками нарушения механизмов латерального ингибирования клеток эндотелия нейрогенных ниш. Интересной находкой является увеличение экспрессии GPR81 рецепторов лактата в обеих нейрогенных нишах, что ассоциировано с присутствием в этих зонах увеличенного количества незрелых клеток эндотелия. Ингибитор ангиогенеза TNP-470 не влияет на когнитивный статус контрольных животных, однако усугубляет проявления когнитивного дефицита у животных с интрагиппокампальным введением Аβ, что сопровождается изменением субпопуляционного состава клеток эндотелия и экспрессии GPR81. Экспрессия BDNF и VEGF не нарушена у животных с моделью БА. У животных линии 5xFAD регистрируется значимое уменьшение количества BrdU+ клеток эндотелия, отсутствует увеличение количества tip-клеток и stalk-клеток эндотелия в SGZ, префронтальной и энторинальной коре, но возрастает число клеток tip-, stalk-фенотипа в SVZ, где увеличена экспрессия GPR81 и количество незрелых клеток эндотелия. В обеих использованных моделях БА зарегистрированы признаки непродуктивного ангиогенеза в ткани головного мозга (уменьшение ветвления и плотности сосудистой сети во всех тестируемых регионах головного мозга) и дефектного барьерогенеза (но не проявляющегося значимым увеличением проницаемости ГЭБ). В моделях in vitro показано, что токсическое действие Аβ на клетки церебрального эндотелия сопровождается нарушением структуры внутриклеточных мембран, увеличением экспрессии белка-регулятора слияния митохондрий, интенсификацией апоптоза, увеличением продукции лактата, и проявляет зависимость от глутамат-индуцированной активности нейронов. Успешно осуществлена направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки-компоненты нейроваскулярной единицы/гематоэнцефалического барьера (клетки эндотелия, нейроны, астроциты). Таким образом, получены новые фундаментальные данные о механизмах аберрантного церебрального ангиогенеза, связи нарушений ангиогенеза и ремоделирования сосудов с нейрогенезом в нейрогенных нишах головного мозга, о роли изменения субпопуляционного состава клеток эндотелия в развитии непродуктивного церебрального ангиогенеза при нейродегенерации, о влиянии ингибитора ангиогенеза на когнитивный дефицит, изменении субпопопуляций и зрелость клеток эндотелия при хронической нейродегенерации in vivo; об эффектах бета-амилоида на клетки эндотелия в статических и динамических моделях НВЕ/ГЭБ in vitro, в том числе при стимуляции активности нейронов; успешно выполнены протоколы и доказана возможность генерации клеток-компонентов НВЕ/ГЭБ из иПСК для получения персонифицированных in vitro моделей. Результаты создают основу для реализации следующего этапа проекта по детализации механизмов развития аберрантного ангиогенеза/барьерогенеза при болезни Альцгеймера. На втором этапе работы опубликованы 4 (с учетом квартиля Q1 – 5) статьи в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science/Scopus. Результаты представлены (устные доклады) на 5 конференциях (международной и российских).