Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проведена разработка методов получения и наработка компонентов имплантатов и их характеристика: 1. Отработаны три метода синтеза силикатной керамики - диопсида - твердофазным методом, золь-гель методом с протеканием окислительно-восстановительных реакций (ОВР), золь-гель методом с протеканием ОВР и механоактивацией. 2. Получен пористый полимерный биомиметический каркас из сверхвысокомолекулярного полиэтилена (СВМПЭ) и отработан метод введения порошка диопсида в полимерную матрицу СВМПЭ. Размер пор пористого СВМПЭ с диопсидом имеет среднее значение 260 ± 120 мкм, что соответствует диапазону пор губчатой кости. Диопсид равномерно распределен. Краевой угол смачивания, определенный методом сидячей капли составил 84,7 ± 6,3°. Согласно механическим испытаниям на сжатие максимальное напряжение при фиксированной деформации 50% составило 1,49 ± 0,10 МПа, а модуль Юнга 0,19 МПа. Наработано 11 и 17 дисков пористых СВМПЭ и СВМПЭ с диопсидом соответственно, диаметром 26 мм и толщиной 4 мм и по 7 дисков толщиной 1 мм для проведения экспериментов. 3. Наработан очищенный деминерализованный костный матрикс (ДКМ) из костей крупного рогатого скота, из которого изготовили диски диаметром 4 мм, высотой 1 мм (300 шт), крошку размером 1-2 мм (1 грамм), блоки размером 6 × 6 × 6 мм. 4. Наработаны в необходимых количествах рекомбинантные белки - фактор роста кости BMP-2, а также лизостафин и дисперсин B, обладающие антибактериальной и антибиоплёночной активностью. Проведены исследования имплантатов in vitro: 1. Разработаны методы введения рекомбинантных белков в порошок диопсида и СВМПЭ/диопсид. 2. Изучена сорбционная ёмкость порошка диопсида и пористых СВМПЭ и СВМПЭ/диопсид по отношению к белкам. Показано, что варианты порошка диопсида, полученные тремя различными методами, практически не отличаются по сорбционной ёмкости. Сорбционная ёмкость диопсида составляет >150 мкг/мг для BMP-2 (что более чем в 3 раза выше ёмкости гидроксилапатита, кальций-фосфатной керамики, широко применяемой для разработки костно-пластических материалов) и ~ 5-7 мкг/мг для лизостафина и дисперсина B. Введение диопсида существенно повышает ёмкость пористого СВМПЭ, при этом тенденции по ёмкости носителя по отношению к разным белкам сохраняются. 3. С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или по биологической активности изучена кинетика выхода белков из порошка диопсида и пористых СВМПЭ и СВМПЭ с 20% диопсидом in vitro. При оценке по ИФА показано, что для BMP-2 характерен взрывной выход в первые 1-2 суток с последующим постепенным выходом примерно по 0,4–0,5% в сутки. В случае лизостафина большая часть белка выходила в первые часы, после чего выход белка практически не происходил. Выход белков из пористого СВМПЭ с диопсидом имел существенно более постепенный характер по сравнению с выходом из СВМПЭ. Выход лизостафина оценивали также по антибактериальной активности (замедлению роста бактерий) при раскапывании на чашку Петри, засеянную золотистым стафилококком. Минимальная концентрация лизостафина, определяемая таким способом - 0,3 мкг/мл. Количество лизостафина, достаточное для замедления роста стафилококка, высвобождалось в течение первых 24 ч, что хорошо согласуется с результатами, полученными по ИФА. В случае пористого СВМПЭ с диопсидом количества лизостафина, вышедшего даже на 9-е сутки после начала эксперимента, хватало для достоверного снижения биомассы заранее сформированной биоплёнки стафилококка. Для оценки выхода дисперсина B определяли каталитическую активность элюированного белка. Дисперсин B, адсорбированный на диопсиде, выходил в очень небольших количествах: в течение первого часа - всего 0,4 мкг белка на мг диопсида из нанесённых примерно 5 мкг/мг. Остальной белок оставался прочно связанным на диопсиде. 4. Изучены антибактериальные свойства диопсида с лизостафином. Его минимальная ингибирующая концентрация (МИК) - 0,06 мг/мл, что эквивалентно 0,3 мкг/мл адсорбированного лизостафина, минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - 0,125 мг/мл, что соответствует ~ 0,6 мкг/мл адсорбированного лизостафина. МИК и МБК свободного лизостафина на том же штамме составляют 0,1 мкг/мл. Таким образом, диопсид с лизостафином обладает значительной антибактериальной активностью, которая, однако, немного ниже активности эквивалентного количества свободного лизостафина. 5. Свободный лизостафин и диопсид с лизостафином демонстрируют дозозависимый эффект при добавлении к уже сформированным биоплёнкам стафилококка, причем концентрация 0,07 мкг/мл свободного лизостафина или 0,1 мг/мл диопсида с лизостафином (эквивалентно 0,6 мкг/мл адсорбированного лизостафина) приводит к почти полному разрушению биопленки. Дисперсин B продемонстрировал отсутствие активности при добавлении к уже сформированным биоплёнкам даже в очень высоких концентрациях - 500 мкг/мл. Дальнейшее его использование в проекте не представляется целесообразным. Проведены исследования имплантатов in vivo: 1. Оценена остеоиндуктивность смешанных с гиалуроновой кислотой частиц двух видов силикатной керамики - диопсида и волластонита, содержащих или не содержащих BMP-2, на модели инъекционного введения под надкостницу черепа у мышей. Показана высокая остеоиндуктивность частиц диопсида, содержащих BMP-2 - под надкостницей образовывалась новая костная ткань трабекулярного строения с костным мозгом; частицы волластонита с BMP-2 в большинстве случаев, хотя и вызывали незначительное и неравномерное образование костной ткани, но при этом наблюдалась достаточно сильная воспалительная реакция. Отдельным результатом является разработка мышиной модели имплантации под надкостницу черепа - удобной, хорошо воспроизводимой и экономичной по сравнению с ранее описанной в литературе моделью на крысах. 2. Проведена оценка остеоиндуктивных свойств частиц диопсида с введенным BMP-2, смешанных с гиалуроновой кислотой, при совместном применении с дисками из ДКМ в качестве поддерживающего каркаса на модели краниальных дефектов критических размеров у мышей на сроках 7, 12, 21 и 63 суток. В группе с диопсидом, насыщенным BMP-2, с самых ранних сроков наблюдалась картина выраженного репаративного остеогенеза, приводящего к практически полному заполнению дефекта трабекулярной костной тканью с костным мозгом, в группе с диопсидом без BMP-2 наблюдались лишь начальные стадии перестройки костной ткани. 3. В эксперименте с введением суспензии в гиалуроновой кислоте порошка диопсида с/без BMP-2 при использовании дисков из ДКМ в качестве поддерживающего каркаса на модели эктопического остеогенеза при внутримышечной имплантации в группе с BMP-2 наблюдался мощный эктопический остеогенез с образованием покрытых надкостницей костных структур, состоящих из трабекулярной кости с костным мозгом внутри. 4. Проведён анализ остеоиндуктивных свойств пористого СВМПЭ и пористого СВМПЭ с 20% диопсидом, насыщенных BMP-2, на модели краниальных дефектов критических размеров у мышей с помощью гистологии и микрокомпьютерной томографии. В порах обоих типов имплантатов, преимущественно с краёв имплантатов, через 9 недель формировалась новая трабекулярная кость с включением костного мозга, в группе с диопсидом относительное количество новообразованной костной ткани, а также степень минерализации по микроКТ были более выражены. 5. Исследованы остеоиндуктивные свойства пористых СВМПЭ и СВМПЭ с диопсидом с добавлением и без добавления BMP-2 на сегментарной модели бедренной кости мыши с интрамедуллярной фиксацией спицей на сроке 12 недель. В двух группах с BMP-2 по результатам микроКТ наблюдается частичная или практически полная минерализация тканей в области дефекта. В порах имплантата наблюдается репаративный остеогенез с образованием крупных костных структур, в отдельных случаях, с фокусами костного мозга. В группе с BMP-2, где в качестве носителя был использован СВМПЭ с диопсидом, наблюдается тенденция более полного замещения области дефекта новообразованной костной тканью. СВМПЭ с диопсидом и BMP-2 будет использован в качестве основы имплантатов при проведении экспериментов на инфекционной модели остеосинтеза в 2023 году.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В качестве гидрогеля для разработки гибридных имплантатов с остеогенными и антибактериальными свойствами был выбран гидрогель на основе полисахаридов - геллановой и ксантановой камедей, преимуществом которого является двойная сшивка: помимо физической сшивки ионами металла (Ca2+) осуществляется сшивка при температурном переходе. Такие гидрогели обладают высокой пластичностью и способны удерживать большое количество диопсида, используемого в проекте в качестве носителя рекомбинантного BMP-2. Отработаны условия введения в геллан-ксантановый гидрогель 0,5, 1 и 3% порошка диопсида, полученного золь-гель методом с ОВР и механоактивацией на предыдущем этапе выполнения проекта. ИК-Фурье спектр чистого гидрогеля демонстрирует присутствие функциональных групп, характерных для полисахаридов. При добавлении диопсида отмечается появление функциональных групп диопсида, которые из-за его высокого содержания перекрывают полисахаридные группы, находящиеся в том же диапазоне волновых чисел. Отработаны условия лиофилизации геллан-ксантановых гидрогелей, в том числе содержащих диопсид, приводящие к получению пористых образцов с параметрами, оптимальными для проведения in vivo экспериментов: пористость лиофилизированных гидрогелей, полученных после замораживания на -20 °С, составляет ~60 %, средний диаметр пор – около 500 мкм. Исследована степень набухания лиофилизированных гидрогелей с различным содержанием диопсида в PBS. Через 1 час степень набухания не меняется и составляет ~20% для гидрогеля без диопсида и ~10% для гидрогелей с диопсидом. Ограниченная степень набухания делает возможным использование данных гидрогелей для экспериментов in vivo. Поскольку при введении в гидрогель различных количеств диопсида разницы в степени набухания не наблюдалось, дальнейшая работа была проведена с гидрогелями, содержащими 3% диопсида, что дает возможность введения в гидрогель максимального количества BMP-2. Модуль упругости геллан-ксантановых гидрогелей, измеренный методом сжатия между параллельными пластинами с помощью микротензиометра Microsquisher (CellScale, Канада), составляет около 2 kPa, что хорошо согласуется с результатами исследований биомеханических свойств гидрогелей похожего состава. Отработаны методы введения в геллан-ксантановый гидрогель рекомбинантных белков: BMP-2, обеспечивающего остеогенность, и лизостафина, обеспечивающего антибактериальные свойства материалов. BMP-2 вводили в гидрогель в адсорбированном на частицах диопсида виде, а лизостафин - непосредственно в гидрогель. Отработаны условия получения стерильных лиофилизированных пористых геллан-ксантановых имплантатов с 3% диопсидом, содержащих BMP-2 и лизостафин, которые были использованы в дальнейших экспериментах. Изучена кинетика выхода BMP-2 и лизостафина из гидрогелей с 3% диопсида. Наблюдался устойчивый, постепенный выход BMP-2, который должен поддерживать неоостеогенез в области имплантации в течение достаточно длительного времени, и быстрый, в течение 1-3 часов выход основной массы лизостафина, который должен обеспечивать элиминацию возбудителя в области дефекта в кратчайшие сроки после операции. Для всех вариантов гидрогелей продемонстрирован достаточно высокий уровень биосовместимости, повышающийся в присутствии в гидрогелях белков. В in vivo эксперименте по оценке остеоиндуктивных свойств геллан-ксантановых гидрогелей с 3% диопсидом и рекомбинантными белками BMP-2 и лизостафином на модели имплантации в краниальные дефекты критического размера у мышей показано, что в первой группе животных с имплантатами из геллан-ксантанового гидрогеля с частицами диопсида через 4 недели новообразованная минерализованная костная ткань отсутствовала, в то время как во второй и третьей группах – с BMP-2 и BMP-2 и лизостафином через 8 недель наблюдалась зрелая костная ткань с костным мозгом. Полученные результаты свидетельствуют о правильно подобранных параметрах имплантатов. Важным результатом является возможность использования, по крайней мере, в случае ненагружаемых дефектов, лиофилизированных гидрогелевых имплантатов самих по себе, без поддерживающего каркаса. Проведена оценка биодеградации геллан-ксантановых гидрогелей in vitro и in vivo. На сроке наблюдения (8 – 12 недель) показана очень постепенная биодеградация гидрогелей, что должно обеспечить достаточное количество времени для наращивания в первоначально инфицированном дефекте зрелой костной ткани после элиминации инфекции. В проведённых микробиологических экспериментах in vitro показано, что полученные образцы геллан-ксантанового гидрогеля с диопсидом, BMP-2 и лизостафином обладают выраженными антибактериальными и антибиоплёночными свойствами. Выраженные антибактериальные свойства геллан-ксантановых гидрогелей с диопсидом, BMP-2 и лизостафином продемонстрированы в эксперименте in vivo на краниальных дефектах критического размера у мышей с инфекцией стафилококком. В контрольной группе с BMP-2 на сроке 4 недели по данным микроКТ наблюдалась полная минерализация дефекта, что соответствовало зарастанию пор имплантата новообразованной костной тканью. В случае, если в дефекты с таким имплантатом вводили стафилококк, ни у одного животного такой группы минерализации и образования костной ткани не наблюдалось. При этом в присутствии лизостафина BMP-2 вызывал мощный костный рост в области имплантации у всех инфицированных животных. То есть, присутствующий в имплантатах лизостафин в первые же часы полностью подавлял инфекцию и обеспечивал возможность осуществления нормального процесса репаративного остеогенеза. Необходимо отметить, что у 80% инфицированных животных в группе без лизостафина к концу эксперимента инфекция элиминировалась самопроизвольно из-за мощного антистафилококкового иммунитета, характерного для грызунов. Тем не менее, полученные результаты по остеогенезу позволяют считать краниальную модель со стафилококковой инфекцией на мышах адекватной инфекционной моделью для оценки эффективности бифункциональных имплантируемых материалов, обладающих одновременно остеогенной и антибактериальной активностями. Также в 2023 г. была отработана модель сегментарного дефекта бедренной кости мыши с имплантацией блоков пористого СВМПЭ с диопсидом и интрамедуллярной фиксацией спицей, осложнённая инфекцией S. aureus. Эксперимент включал 4 группы по 6 животных: группу 1 с BMP-2, группу 2 с BMP-2 и инфекцией стафилококком, группу 3 с ВМP-2 и лизостафином, группу 4 с ВМP-2, лизостафином и инфекцией стафилококком. По результатам микроКТ у нескольких животных групп 1 и 3 (без инфекции), а также, 4 (с инфекцией и лечением лизостафином) наблюдалось полное двухстороннее сращение материнской кости и пронизанного новообразованной костной тканью имплантата. В группе 2 с BMP-2 и инфекцией S. aureus ни у одного животного сращения с материнской костью и формирование костной ткани в порах имплантата не наблюдалось. Результаты остеогенеза оценивали с помощью микроКТ по четырём различным параметрам. По всем параметрам группа 2 – с BMP-2 и инфекцией – достоверно отличалась от группы 1 – c BMP-2 и без инфекции. Группа 4 - с BMP-2, инфекцией и лечением лизостафином - по 3 параметрам достоверно отличалась от группы 2 с BMP-2, инфекцией, но без лечения. Это хорошо коррелирует с гистологическими различиями. При сравнении групп 2 и 4 через 9 недель наблюдалось достоверное различие на порядок по инфицированности стафилококком. С помощью окраски гистологических препаратов по Граму было продемонстрировано наличие бактериальных биоплёнок в инфицированных дефектах. На данной модели нами также был отработан метод оценки инвалидности мышей на приборе Incapacitance Meter (Global Bio Inc, США), достоверных различий по степени инвалидности в группах с инфекцией с лечением и без него не наблюдается, однако есть разница между инфицированными и неинфицированными группами, и, таким образом, метод можно считать отработанным и использовать в последующих экспериментах с сегментарной моделью бедренной кости мыши. По результатам работы по проекту в 2023 году опубликованы 4 статьи и 3 тезисов докладов.