КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-15-00258

НазваниеИсследование маркёров повреждения и способов протекции нейроваскулярной единицы у пациентов детского возраста в кардиохирургии

РуководительГригорьев Евгений Валерьевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний", Кемеровская обл (Кузбасс)

Период выполнения при поддержке РНФ 2022 г. - 2024 г. 

Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаНейроваскулярная единица, кардиохирургия, дети, искусственное кровообращение, головной мозг, нейроны, исследования клеточных культур, врожденные пороки сердца

Код ГРНТИ76.29.00

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Количество проводимых в мире кардиохирургических операций как взрослым, так и детям возрастает ежегодно, вместе с этим возрастает и актуальность изучения их влияния на головной мозг пациентов. Кардиохирургия всегда лидировала по количеству послеоперационных церебральных осложнений, среди которых послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) и послеоперационный делирий (ПОД), то есть церебральные дисфункции, не имеющие четкой клинической картины и определенного очага возникновения в головном мозге. Причем, оценка наличия ПОКД в послеоперационном периоде в обычной клинической практике почти невозможна, потому что по ее определению требуется сравнение с результатами дооперационного нейропсихологического тестирования [1]. У детей наиболее валидированной шкалой для оценки когнитивных нарушений признается шкала Bayley [2, 3], однако ее использование сопряжено с некоторыми трудностями, обусловленными, как сложностью самой шкалы, так и временем, для проведения тестирования по ней. Таким образом, она не подходит не применения в рутинной кардиохирургической практике. Оценка наличия ПОД проще и основывается на однократном тестировании пациента по одной из специальных шкал. Для детей шкалой с наибольшим уровнем чувствительности и специфичности является шкала CAPD (Cornell Assessment of Pediatric Delirium) [4], причем, начиная с периода новорожденности, как показали недавние исследования [5]. Именно относительная простота в применении существенно повысила выявляемость делирия в последние годы и увеличило количество исследований, связанных его изучением. Согласно им, частота встречаемости послеоперационного делирия в детской практике варьирует от 12 до 65 % [7, 8, 9, 10]. Однако, эти данные касаются исследований, посвященных всем хирургическим профилям, оперативного лечения пациентов с ВПС. Объяснить это можно несколькими факторами: во-первых, операции по коррекции ВПС чаще всего проводятся в условиях искусственного кровообращения, что сразу предполагает большой набор патологических факторов. Во-вторых, любой ВПС представляет собой строго индивидуальную гемодинамическую картину, разумеется, с предельно вариабельным уровнем церебральной перфузии и оксигенации, что влияет на когнитивные способности ребенка как до операции, так и после [11]. Однако, ПОД – это форма когнитивного дефицита, которая поддается диагностике, в отличие от ПОКД, при которой имеется определенный уровень повреждения НВЕ, но выявить его сложно, особенно, в ближайшем послеоперационном периоде. По этой причине выявление наличия и объема церебрального повреждения является важным вектором в исследованиях, посвященных операциям у детей. Тем более, что головной мозг ребенка, особенно первого года жизни, имеет большое количество особенностей – В нём происходит активный процесс дифференцировки нейронов и синаптогенеза, активный рост глиальных клеток и миелинизация, он обладает высокой гидрофильностью и скоростью метаболизма [12-14]. Все это делает его уязвимым к любым патологическим факторам, чем и обусловлена такая высокая частота послеоперационных когнитивных расстройств. Имеет немаловажное значение и то, что пока почти неизученным остается вопрос влияния какого-либо повреждения и дисфункции НВЕ в детском возрасте на дальнейшее развитие ребенка. При этом существуют единичные исследования, доказывающие снижение когнитивных способностей у детей, перенесших кардиохирургическую операцию через год после нее [15]. ИК, зачастую сопровождающее кардиохирургические операции, располагает большим количеством патологических факторов, угрожающих головному мозгу пациента, особенно детского возраста в силу описанных ранее причин. Воздействие ИК может быть как непосредственным (эмболия, гипоксия, гемодинамические сдвиги), так и опосредованно через инициацию СВО из-за контакта крови с экстракорпоральным контуром, гемолизом и нарушений нормального терморежима [16-19]. Именно поэтому важным направлением является выявление вклада каждого из этих факторов в процесс повреждения НВЕ для их дальнейшей минимизации их действия. В этом играют свою роль маркёры СВО, такие как интерлейкин-1, 6, 10, а также ФНО альфа. Их роль в диагностике СВО доказана и обоснована достаточно давно, однако они лишь отражают возможность перехода СВО на НВЕ и развития там нейровоспаления с последующей церебральной дисфункцией [20, 21]. По этой причине, более достоверное представление об активности процесса нейровоспаления могут дать специфические сывороточные маркёры, которые являются компонентами НВЕ и выделяется в кровь при ее повреждении. К наиболее изученным из них относятся белок S100-β, нейронспецифическая енолаза (NSE), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), глутамата, окклюдин и клаудина-1. Но проблема состоит в том, что почти во всех исследованиях их роль доказана через корреляцию с клиническими исходами, которая, безусловно имеется и что не умаляет их значимости [22, 23.]. Тем не менее, существует способ получить максимально достоверную информацию о соотношении их концентрации в крови и процессе деструкции НВЕ. Исследования такого типа начались в мире недавно и каждое представляет собой новизну, потому что проводятся они на клеточной модели НВЕ. Исходя из проанализированной информации по тематике нашего проекта можно сделать вывод, что до настоящего момента все исследования, посвященные тематике церебрального повреждения в кардиохирургии, основывались либо на клинической оценке пациента, либо на специфических сывороточных маркёрах. Однако, наиболее точную информацию о влиянии подобного рода операций на нейроны может дать исследование на модели НВЕ с кровью пациентов, подвергнутых такому вмешательству. Такой подход позволит исключить влияние различного рода факторов, искажающих результаты исследования (разнородность выборки пациентов по возрасту и типу ВПС или индивидуальные особенности пациента). Кроме того, предлагаемый проект даст возможность оценить корреляцию уровня маркёров повреждения головного мозга не только с клинической картиной, но и с реальным объемом поражения нейронов. Информация, полученная при реализации предлагаемого проекта, будет иметь научную новизну мирового уровня, поскольку исследования, посвященные НВЕ в кардиохирургии единичны и среди них не встречаются работы с участием пациентов детского возраста. Список литературы: 1. Rasmussen L.S., Jonson T., Kuipers H. et al. Does anesthesia cause postoperative cognitive dysfunction? A randomized study of regional versus general anesthesia in 438 elderly patients // Acta Anaesthesiologica Scandinavica . — 2003. — V. 47, № 9. — Р. 1188-1194 2. Bayley N. Bayley Scales of Infant Development. NY: Harcourt Assessment, 1969. 3. Bayley N. Manual for the Bayley scales of infant development. 2nd ed. SA, TX: The Psycho- logical Corporation, 1993. 4. Bayley N. Bayley scales of infant and toddler development. 3rd ed. SA, TX: Harcourt Assessment Inc, 2006. 5. Traube C, Silver G, Kearney J. Cornell Assessment of Pediatric Delirium: a valid, rapid, observational tool for screening delirium in the PICU. Critcal Care Medicine. 2014;42(3):656-663. https://doi.org/10.1097/CCM.0b013e3182a66b76 6. Silver G, Kearney J, Traube C, Hertzig M. Delirium screening anchored in child development: The Cornell Assessment for Pediatric Delirium. Palliative&Supportive Care. 2015;13(4):1005-1011. doi:10.1017/S1478951514000947 7. Traube C, Silver G, Reeder RW, et al. Delirium in critically ill children: an international point prevalence study. Crit Care Med 2017; 45: 584–90. 8. Traube C, Silver G, Gerber LM, et al. Delirium and mortality in critically ill children: epidemiology and outcomes of pediatric delirium. Crit Care Med 2017; 45: 891–98. 9. Silver G, Traube C, Gerber LM, et al. Pediatric delirium and associated risk factors: a single-center prospective observational study. Pediatr Crit Care Med 2015; 16: 303–09 10. Calderon J, Bellinger DC. Executive function deficits in congenital heart disease: why is intervention important? Cardiology in the Young. 2015; 25(7): 1238‐1246. https://doi.org/10.1017/S1047951115001134 11. Patel AK, Biagas KV, Clarke EC. Delirium in Children After Cardiac Bypass Surgery. Pediatric Critical Care Medicine. 2017;18(2):165‐171. https://doi.org/0.1097/PCC.0000000000001032 12. Jevtovic-Todorovic V. General Anesthetics and Neurotoxicity: How Much Do We Know?. Anesthesiology clinics. 2016; 34(3): 439-451. https://doi.org/10.1016/j.anclin.2016.04.001 13. Developmental Disorders of the Central Nervous System. Developmental Medicine & Child Neurology. 2008 Nov 12;2(2):103–8. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.1960.tb05151.x 14. Gunn JK, Beca J, Hunt RW, Goldsworthy M, Brizard CP, Finucane K, Donath S, Shekerdemian LS. Perioperative risk factors for impaired neurodevelopment after cardiac surgery in early infancy. Arch Dis Child. 2016 Nov;101(11):1010-1016. doi: 10.1136/archdischild-2015-309449. 15. Stehouwer M.C., Boers C., Vroege R., Kelder J.C., Yilmaz A., Bruins P. Clinical evaluation of the air removal characteristics of an oxygenator with integrated arterial filter in a minimized extracorporeal circuit. The International Journal of Artificial Organs. 2011; 34 (4): 374–382. https://doi.org/10.5301/ijao.2011.7749 16. Guenther U, Theuerkauf N, Frommann I, Brimmers K, Malik R, Stori S, Scheidemann M., Putensen C., Popp J.. Predisposing and precipitating factors of delirium after cardiac surgery. A prospective observational cohort study. Annals of Surgery. 2013; 257: 1160–1167. https://doi.org/10.1097/sla.0b013e318281b01c 17. Hirata Y. Cardiopulmonary bypass for pediatric cardiac surgery. General Thoracic and Cardiovascular Surgery. 2018; 66 (2): 65-70. https://doi.org/10.1007/s11748-017-0870-1 18. Engelman R, Baker RA, Likosky DS, et al. The Society of Thoracic Surgeons, The Society of Cardiovascular Anesthesiologists, and The American Society of ExtraCorporeal Technology: Clinical Practice Guidelines for Cardiopulmonary Bypass--Temperature Management during Cardiopulmonary Bypass. J Extra Corpor Technol. 2015;47(3):145-154. PMID: 26543248 19. Григорьев Е.В., Шукевич Д.Л., Плотников Г.П., Хуторная М.В., Цепокина А., Радивилко А.С. Нейровоспаление в критических состояниях: механизмы и протективная роль гипотермии. Фундаментальная и клиническая медицина. 2016;1(3):88-96. 20. Christov A, Ottman JT, Grammas P. Vascular inflammatory, oxidative and protease-based processes: implications for neuronal cell death in Alzheimer's disease. Neurological Research. 2004; 26 (5): 540-546. https://doi.org/10.1179/016164104225016218 21. Краснов А.В. Астроцитарные белки головного мозга: структура, функции, клиническое значение. Неврологический журнал. 2012; 17 (1): 37-42. 22. Rothoerl R. D., Brawanski A., Woertgen C. S100B protein serum levels after controlled cortical impact injury in the rat. Acta Neurochir. (Wien) 2001; 142 (2): 199—203. 23. Schafer B. W., Fritschy J. M., Murmann P. et al. Brain S100A5 is a novel calciumzinc and copper ionbinding protein of the EFhand super family. J. Biol. Chem. 2000; 275 (39): 30623—30630.

Ожидаемые результаты
Используя экспериментальную модель НВЕ появится возможность максимально точно определить, влияние СВО на головной мозг пациента при кардиохирургических операциях. Для этого, будет проведен забор крови в контрольных точках у исследуемых пациентов и далее, с помощью культуры НВЕ планируется оценка воздействия СВО на НВЕ в условиях нормальной оксигенации и нормотермии, которые имитируют течение большинства кардиохирургических операций в условиях ИК без каких-либо осложнений. Таким образом станет возможным оценить, существует ли зависимость между концентрацией маркёра СВО (а следовательно, и его выраженностью) и объемом повреждения головного мозга в интраоперационном периоде. Данный эксперимент позволит определить вклад СВО в развитие нейровоспаления и деструкции нейронов. Вторым типом условий для инкубации клеток НВЕ станет нормотермия с пониженным содержанием кислорода в среде, имитирующим интраоперационную гипоксию, как прямой повреждающий фактор для головного мозга. Далее будет выполнено сравнение уровня повреждения клеток НВЕ в группе с нормальной оксигенацией и гипоксией, что продемонстрирует степень влияния гипоксии. В свою очередь, предполагается и сравнение между собой групп с минимально и максимально выраженным СВО. Такое наблюдение, в свою очередь, сможет ответить на вопрос о том, что вносит больший вклад в церебральное повреждение у пациентов при коррекции ВПС: факторы, провоцирующие СВО или гипоксия. Данное наблюдение будет иметь прямое практическое применение, потому что сможет ответить на вопрос какая из стратегий эффективнее: применение эритроцитарной массы для заполнения аппарата ИК и повышенный риск развития СВО или отказ от трансфузии и риск развития гемической гипоксии. Помимо этого, будет влиянии гипотермии на нейроны при нормальном кислородном статусе, а также в условиях аноксии, как имитации циркуляторного ареста, для чего планируется инкубация НВЕ с сывороткой при температуре 23о С. Дополнительно анализу будет подвергнут вклад СВО в деструкцию нейронов при таких температурных условиях. Однако, главным в решении заявленной задачи является оценка гипотермии для протекции головного мозга. Для этого планируется сравнительный анализ повреждения НВЕ при воздействии аноксии в нормальных температурных условиях и при глубокой гипотермии в 23о С. Кроме того, сопоставление гипотермического режима при нормальном кислородном статусе и в условиях аноксии позволит выявить, обладает ли протективным действием селективная церебральная перфузия при операциях по коррекции ВПС с циркуляторным арестом, когда происходит кровоснабжение не всего организма пациента, а только его головного мозга. Кроме того, появится решение вопроса, имеет ли преимущество такая методика селективной перфузии, перед полным циркуляторным арестом, что является актуальным и не до конца разрешенным вопросом в практической кардиохирургии [Maier S, 2016] Дополнительно, при сопоставлении концентрации маркёров СВО и церебрального повреждения в крови и объема повреждения культуры НВЕ при инкубации с той же сывороткой, появится возможность уточнения рефференсных значений для этих маркёров. На основании корреляционного и дискриминантного анализа между маркерами будет определена взаимосвязь между СВО и нейровоспалением. В клинической части исследования, по результатам анализа всех параметров течения периоперационного периода, станет доступным выявление факторов развития повреждения НВЕ при коррекции врожденных пороков сердца у детей в условиях искусственного кровообращения, что вкупе с этапом in vitro позволит разработать алгоритмы диагностики и профилактики такого воздействия данного типа операций на головной мозг ребенка. Все перечисленное приведет к улучшению хирургического лечения детей с ВПС путём оптимизации диагностики и профилактики интраоперационного церебрального повреждения, что положительно скажется не только на ближайшем, но и на отдаленном послеоперационном периоде.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Клинический этап исследований В ходе клинических исследований была изучена концентрация маркеров маркёров церебрального повреждения (S-100-ß, NSE, GFAP) и системного воспалительного ответа (IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-α) у детей, которым проводилась коррекция септальных дефектов в условиях искусственного кровообращения, в трёх временных точках (до начала оперативного вмешательства, сразу же после завершения искусственного кровообращения и через 16 часов после окончания опеарции). Было выявлено, что пик концентрации маркёров церебрального повреждения (S-100-ß, NSE, GFAP) и системного воспалительного ответа (IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-α), приходился на этап после завершения искусственного кровообращения для всех исследованных маркёров, кроме IL-6, у которого максимальная концентрация наблюдалась через 16 часов после операции. Кроме того, был проведен сравнительный анализ всех маркёров группы пациентов, у которых интраоперационно применялись компоненты донорской крови и группы пациентов, где трансфузия не использовалась. Были выявлены статистически более высокие показатели маркёров церебрального повреждения на этапе после завершения ИК для S-100-ß, NSE и GFAP и через 16 часов после операции для GFAP. Маркёры системного воспалительного ответа  IL-1 b TNF-α были значимо выше после завершения ИК, а IL-6 и IL-10  через 16 часов после оперативного вмешательства. Наблюдалась слабая и умеренная корреляция степени выраженности церебрального повреждения и системного воспалительного ответа с фактом применения эритроцитарной взвеси и её дозой на кг массы тела пациента. Приведённые данные являются подтверждением того, что интраоперационная трансфузия выступает источником повышенного уровня системного воспалительного ответа и нейровоспаления с дальнейшим церебральным повреждением у детей при оперативной коррекции септальных врождённых пороков сердца. Результаты экспериментов in vitro Была проведена разработка и культивирование модели нейроваскулярной единицы (НВЕ) для изучения интраоперационного влияния гипоксии и системного воспалительного ответа на головной мозг пациента при кардиохирургических операциях. Для определения эффектов ИЛ-6 (как показателя системного воспалительного ответа) на клеточную модель НВЕ in vitro в культуральную среду добавили образцы сыворотки с минимальной и максимальной концентрацией ИЛ-6. Были сформированы группы с зависимости от концентрации ИЛ-6 в образце. 1. Группа «Контроль» – интактная модель НВЕ. 2. Группа «Минимум» - образцы с минимальным содержанием ИЛ-6 в культуре. 3. Группа «Максимум» - образцы с минимальным содержанием ИЛ-6 в культуре. Для изучения влияния гипоксии, в соответствии с условиями гипоксической инкубации НВЕ были сформированы группы: 1. Контрольная – стандартные условия культивирования: N2-75%, O2-20%, CO2-5% 2. Гипоксия 1: N2-99 %, O2-1 %, t-37 Со. 3. Гипоксия 2: N2-98 %, O2-2 %, t-37 Со. 4. Гипоксия 3: N2-97 %, O2-3 %, t-37 Со. 5. Гипоксия 4: N2-96 %, O2-4 %, t-37 Со. При оценке влияния условий гипоксии на показатель трансэндотелиального сопротивления выявлено, что статистически значимые изменения начинаются через 4 часа после воздействия. Так в группах Гипоксия 1 и Гипоксия 2 через 4 часа после воздействия показатель ТЭС снизился на 10% по сравнению с контролем. При этом к 24 часу после воздействия показатель уменьшился на 30% в группе 1, 20% в группе 2 и 10% в группе 3, по сравнению с контролем (p<0,03). В целом это подтверждает факт влияния даже краткосрочной гипоксии на величину ТЭС. При оценке влияния ИЛ-6 гипоксии на показатель трансэндотелиального сопротивления выявлено, что через 2 часа ТЭС в группе «Минимум» уменьшился на 5%, но без статистически значимой разницы по сравнению с контролем, а в группе «Максимум» на 7,5% (р<0,05) по сравнению с контролем. Через 4 часа после воздействия показатель ТЭС снизился, по сравнению с контролем, на 15% в группе «Минимум» и на 25% в группе «Максимум» (р<0,03). К 24 часу после воздействия, показатель величины ТЭС увеличился, но оставался значимо ниже в группе «Максимум» и был на 15% ниже контрольных показателей (р< 0,03). Таким образом, влияние сыворотки крови, содержащей ИЛ-6 заключается в уменьшении величины ТЭС, однако носит обратимых характер, при этом воздействие по сравнению с гипоксией более выраженные и быстрые, но кратковременные. Так как величина трансэндотелиального сопротивления является показателем функционального состояния эндотелия в ГЭБ и были обнаружены его изменения, были проведены исследования проницаемости для красителя Lucifer Yellow. Влияние кратковременной гипоксии на проницаемость для LY было зафиксировано через 60 минут в группах Гипоксия 1 и Гипоксия 2 по сравнению с контролем. Так через 1 час проницаемость увеличилась на 20% в обеих группах (р<0,05) и при этом не изменилась в группах Гипоксия 3 и Гипоксия 3. Через 90 минут после воздействия Проницаемость увеличилась в группе Гипоксия 1 на 45% (р<0,01) и на 40% в группе Гипоксия 2 (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. В группах Гипоксия 3 и Гипоксия 4 статистически значимых изменений не обнаружено. Эффекты сыворотки крови пациентов на проницаемость: через 60 минут от воздействия наблюдали увеличение относительной проницаемости на 15-20% (р<0,03). Интересно, что через 90 минут проницаемость в обеих экспериментальных группах не отличалась от контрольной группы, что подтверждает предположение о быстром, но кратковременном и, возможно обратимом эффекте.

 

Публикации

1. Ивкин А.А., Григорьев Е.В., Моргун А.В. Обоснование исследования защиты нейроваскулярной единицы на клинической модели искусственного кровообращения Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, - (год публикации - 2022)

2. Ивкин А.А., Чермных И.И., Григорьев Е.В., Борисенко Д.В., Балахнин Д.Г. База данных детей, оперированных по поводу коррекции врождённых септальных пороков сердца -, 2022623130 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO С целью диагностики влияния гипотермии и системного воспалительного ответа, на головной мозг при кардиохирургических операциях было проведено экспериментальное исследование с использованием модели нейроваскулярной единицы. На этап исследования in vitro из 50 пациентов было отобрано по 3 образца сыворотки с наибольшей и наименьшей концентрацией ИЛ-6, как имеющая наибольший и наименьший уровень развития системного воспалительного ответа, соответственно Данная сыворотка была получена в контрольной точке сразу же после завершения искусственного кровообращения у пациентов детского возраста при коррекции им септальных врожденных пороков сердца на базе НИИ КПССЗ.. Замороженная сыворотка была транспортирована с соблюдением температурной цепочки в КрасГМУ. В лаборатории КрасГМУ была разработана модель повреждения головного мозга при кардиохирургических операциях на основе клеточной модели нейроваскулярной единицы, которая культивировалась в условиях, аналогичных интраоперационным. Были приготовлены материалы нейроваскулярной единицы и подвергнуты инкубации сывороткой в условиях различных кислородных и температурных режимов. Выполненное количество повторностей эксперимента – 3. ЭТАПЫ РАБОТ 1. Получение первичных культур клеток головного мозга in vitro. 1.1. Выделение церебральных эндотелиоцитов. 1.2. Выделение и культивирование нейросфер. 1.3. Получение астроцитов и нейронов. 1.4. Формирование модели НВЕ in vitro. 2. Формирование экспериментальных групп. Для определения протекторных эффектов гипотермии в условиях аноксии были сформированы группы: 1. Нормоксия 37° – стандартные условия культивирования: N2-75%, O2-20%, CO2-5%, t-37 С. 2. Аноксия 37°: N2-95 %, O2-0%, CO2-5%, t-37 С. 3. Аноксия 28°: N2-95 %, O2-0 %, CO2-5%, t-28 С. 4. Аноксия 24°: N2-95 %, O2-0 %, CO2-5%, t-24 С. 5. Аноксия 20°: N2-95 %, O2-0 %, CO2-5%, t-20 С. Длительность воздействия аноксии составляла 15 минут. На данном этапе исследования оценили воздействия сыворотки с высоким и низким содержанием ИЛ-6 аноксии в нормотермических и гипотермических условиях в клеточной культуре на следующие параметры: экспрессия белков плотных контактов (клаудин 5, ZO-1), экспрессия рецепторов и концентрация в культуральной жидкости цитокинов (IL-1, IL-6, TNF). 3. Иммуноцитохимические исследования Для регистрации целевых молекул-маркеров использовали метод двойного непрямого иммуноцитохимического окрашивания согласно протоколу фирмы-изготовителя антител. 4. Определение концентрации цитокинов (IL-1, IL-6, TNF) в культуральной жидкости РЕЗУЛЬТАТЫ Нами выявлено, что в условиях аноксии происходит статистически значимое снижение экспрессии клаудина во всех экспериментальных группах (р<0,05). Однако, наблюдается тенденция к увеличению экспрессии клаудина 5 при аноксии в условиях гипотермии относительно аноксии при нормотермии, и экспрессия его при 20ºС оказалась статистически значимо выше (р<0,05), чем при 37ºС. Также отмечается статистически значимое негативное влияние сыворотки крови на экспрессию клаудина 5, при этом снижение экспрессии в присутствии в среде сыворотки с высоким содержанием ИЛ-6 статистически значимо выше относительно клеток, инкубировавшихся с сывороткой с низким содержанием ИЛ-6. Важно отметить, что даже в условиях нормоксии присутствие сыворотки в среде культивирования снижало экспрессию клаудина в 2,4 раза в группе низкого ИЛ-6 и в 9,4 раз в группе высокого ИЛ-6. Таким образом, можно сделать вывод, что аноксия и присутствие сыворотки крови в среде приводит к снижению экспрессии клаудина 5, однако гипотермия снижает негативное влияние аноксии на его экспрессию при условии отсутствия сыворотки крови в среде. В ходе эксперимента было установлено, что при воздействии аноксии при 37ºС происходит статистически значимое снижение экспрессии ZO1 с 56,4 у.е. до 45,4 у.е. (р<0,05). Однако при снижении температуры, начиная с 24ºС влияние аноксии на экспрессию ZO1 нивелируется. При анализе влияния сыворотки крови было выявлено статистически значимое снижение флуоресценции ZO1 во всех экспериментальных группах, при этом присутствие в среде культивирования сыворотки с высокой концентрацией ИЛ-6 имело выраженный эффект. Таким образом, на экспрессию ZO1 в эксперименте имело большее влияние присутствие сыворотки крови в среде и концентрация ИЛ-6 в ней, нежели содержание кислорода в воздушной среде. При анализе данных, полученных при изучении экспрессии рецепторов ИЛ-1 клетками НВЕ, было установлено, что инкубация клеток в условиях аноксии при 37ºС приводит к статистически значимому увеличению интенсивности флуоресценции IL1R (р<0,05). При снижении температуры отмечалась тенденция к снижению негативного эффекта аноксии, и начиная с 24ºС это снижение было статистически значимым. Выявлено, что присутствие в среде культивирования сыворотки крови приводило к статистически значимому увеличению экспрессии рецепторов ИЛ-1 во всех экспериментальных группах, независимо от концентрации ИЛ-6 в ней, которое сохранялось при снижении температуры инкубации клеток НВЕ. При анализе данных, полученных при изучении экспрессии рецепторов ИЛ-6 клетками НВЕ, было установлено, что инкубация клеток в условиях аноксии при 37ºС статистически значимо увеличивает экспрессию клетками IL6R (р<0,05). Снижение температуры до 24ºС статистически значимо снижало выраженность действия аноксии на клетки, а при снижении температуры до 20ºС не было выявлено статистически значимых отличий в экспрессии IL6R клетками в условиях нормоксии и аноксии. При анализе действия сыворотки крови на экспрессию рецепторов ИЛ-6 было установлено, что в условиях нормоксии ни сыворотка с низким содержанием ИЛ-6, ни сыворотка с высоким содержанием ИЛ-6 не вызвали изменений в экспрессии рецепторов, однако в условиях аноксии было выявлено статистически значимое повышение флуоресцентного сигнала IL6R с 23,8 у.е. в контрольной группе до 32,5 у.е. в группе низкого ИЛ-6 и до 47,0 у.е. в группе высокого ИЛ-6, причем данный эффект сохранялся при снижении температуры инкубации клеток. При анализе данных, полученных при изучении экспрессии рецепторов TNFR1 клетками НВЕ, было установлено, что инкубация клеток в условиях аноксии при 37ºС приводит к статистически значимому увеличению интенсивности флуоресценции TNFR1 (р<0,05), как и присутствие в среде культивирования сыворотки крови, которое сохранялось при снижении температуры инкубации клеток НВЕ, при этом воздействие сыворотки с высоким содержанием ИЛ-6 оказывало большее влияние на экспрессию TNFR1 (р<0,05). Касательно экспрессии рецептора TNFR2 клетками НВЕ наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение флуоресценции рецепторов с 0,3 у.е. в группе контроля при нормоксии до 8,4 у.е. в группе аноксии, которое сохранялось при снижении температуры инкубации. Культивирование клеток в среде, содержащей сыворотку крови, приводило к статистически значимому увеличению экспрессии TNFR2 во всех экспериментальных группах. После иммуноцитохимического исследования экспрессии клетками рецепторов к цитокинам мы определили концентрацию ИЛ-1, ИЛ-6 и TNF в среде культивирования клеток при воздействии аноксии и сывороток крови. Были обнаружены однонаправленные изменения продукции клетками ИЛ-1 и ИЛ-6) Концентрация в среде интерлейкинов статистически значимо (р<0,05) увеличивалась в условиях аноксии, сохраняясь при снижении температуры до 20ºС. Также статистически значимое повышение концентрации интерлейкинов наблюдалось при инкубации клеток НВЕ в среде с добавлением сывороток крови, причем сыворотка крови с высоким содержанием ИЛ-6 имела более выраженное действие на продукцию ИЛ клетками. При анализе данных, полученных при измерении концентрации TNF в культуральной среде, было выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение продукции TNF клетками в условиях аноксии с 15,7 пг/мл в контроле до 58,2 пг/мл при аноксии и 37ºС, а также до 37,3 пг/мл аноксии и 20ºС. Таким образом, понижение температуры снижало продукцию TNF клетками, но не до уровня контрольной группы. Сюжет на региональном ТВ, посвященный проекту. https://kuzbass1.ru/news/114490

 

Публикации

1. Ивкин А.А. , Григорьев Е.В., Хилажева Е.Д., Моргун А.В. Влияние трансфузии и гипоксии на клеточную модель нейроваскулярной единицы Общая реаниматология, - (год публикации - 2023) https://doi.org/10.15360/1813-9779-2024-1-2350

2. Ивкин А.А., Григорьев Е.В., Балахнин Д.Г., Чермных И.И. Интраоперационная трансфузия как фактор риска церебрального повреждения после кардиохирургических вмешательств у детей...: проспективное наблюдательное исследование ВЕСТНИК ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ ИМЕНИ А.И. САЛТАНОВА, Вестник интенсивной терапии им. А.И. Салтанова. 2023;1:101–114. https://doi.org/10.21320/1818-474X-2023-1-101-114 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.21320/1818-474X-2023-1-101-114

3. Ивкин А.А., Григорьев Е.В., Синицкая А.В. Refraining from Packed Red Blood Cells in Cardiopulmonary Bypass Priming as a Method of Neuroprotection in Pediatric Cardiac Surgery JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vkin, A.A.; Grigoriev, E.; Sinitskaya, A.V. Refraining from Packed Red Blood Cells in Cardiopulmonary Bypass Priming as a Method of Neuroprotection in Pediatric Cardiac Surgery. J. Clin. Med.2023,12,1465. https:// doi.org/10.3390/jcm12041465 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/jcm12041465

4. Ивкин А.А., Балахнин Д.Г.,Борисенко Д.В., Григорьев Е.В. Возможности церебропротекции у детей в кардиохирургии (обзор литературы) Вестник анестезиологии и реаниматологии, 2023. -Т. 20, No 1. - С. 89–96. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.21292/2078-5658-2023-20-1-89-96

5. Ивкин А.А., Григорьев Е.В. Роль гипотермии для церебропротекции при хирургической коррекции врождённых пороков сердца Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, - (год публикации - 2023)

6. - Медицина Кузбасса развивается благодаря новым исследованиям Телеканал «Кузбасс 1 HD», - (год публикации - )