КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-15-00317

НазваниеИсследование клеточных механизмов развития патологий человека, ассоциированных с мутациями митохондриальной ДНК

РуководительВинокуров Андрей Юрьевич, Кандидат технических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева", Орловская обл

КонкурсКонкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
На сегодняшний день известно свыше 400 заболеваний человека, происхождение которых связывают с дисфункцией митохондрий. Большинство из них на фенотипическом уровне проявляется в различных нейродегенеративных и нейромышечных симптомах, однако можно указать и другие группы расстройств. Среди наиболее распространённых патологий выделяют митохондриальную миопатию, синдром митохондриальной энцефаломиопатии, лактат-ацидоза и инсультоподобных эпизодов (MELAS), миоклоническую эпилепсию с рваными красными мышечными волокнами (MERRF), болезни Паркинсона и Альцгеймера, синдром Лея, наследственную глухоту, а также атеросклероз, сахарных диабет, кардиомиопатию и многие другие. Несмотря на сравнительно небольшой размер мтДНК, изучение закономерностей развития патологий, связанных с присутствующими в ней мутациями, представляет собой сложную научную задачу. Это объясняется: а) наличием в клетке большого количества митохондрий и обусловленным этим явлением гетероплазмии, в результате которого патологический фенотип проявляется только при превышении некоторого порогового значения доли мутантных форм мтДНК; б) постоянно протекающими процессами деления и слияния митохондрий, а также митофагии, в результате которых возможно изменение содержания в клетке мутантных форм мтДНК; в) прямым влиянием мутаций на функционирование самих митохондрий. Высокая плотность генов в мтДНК, а также преимущественная их связь с функционированием электронтранспортной цепи (ЭТЦ) (гены непосредственно компонентов ЭТЦ, а также рРНК и тРНК) дают основание предполагать о наличии существенного влияния мутаций мтДНК на обеспечение энергетических потребностей клеток. На сегодняшний день выполнено большое количество исследований нарушений в биоэнергетике клеток, ассоциированных с повреждениями мтДНК. Показано, что при определенном (различном для разных патологий) уровне гетероплазмии возможны изменения в содержании и скорости образования АТФ и АФК. Являясь в определенной степени интегральными для характеристики функционирования системы энергообеспечения клеток, данные показатели нуждаются в детализации. Поэтому научная новизна проекта будет заключаться в результатах комплексных исследований клеточных линий, несущих мутации в разных функциональных участках мтДНК с различными значениями гетероплазмии, включающие изучение широкого набора параметров состояния митохондрий (уровня и скорости образования АТФ, ММП, содержания и скорости превращения коферментов ЭТЦ, скорости образования АФК), митохондриальной динамики, а также связанных с функциональностью митохондрий процессов клеточной сигнализации. Это позволит выявить клеточные и молекулярные механизмы связи мутаций мтДНК и ассоциированных с ними патологий. В результате могут быть разработаны алгоритмы прогнозирования степени риска развития связанных с мутациями в мтДНК заболеваний на основе комплексной оценки параметров состояния митохондрий, а также корректировки состояния митохондрий как инструмента предотвращения или уменьшения последствий развития данных заболеваний. Возможность решения такой комплексной задачи определяется как планируемыми к исследованию объектами, так и совокупностью методологических подходов. В качестве основных объектов исследования будут выступать цибридные линии, каждая из которых характеризуется наличием от 7 до 10 мутаций генов мтДНК с различным уровнем гетероплазмии – от неспособного оказать значительного влияние на функционирование митохондрий до сопоставимого с пороговыми значениями, при которых происходит развитие ассоциированных с мутацией мтДНК патологий. Различия в распределении мутаций по цибридным линиям позволят установить характер зависимости между нарушениями мтДНК и соответствующими им отклонениями в функционировании митохондрий, для чего будут использоваться методы корреляционного анализа. Цибридные линии, которые будут предоставлены НИИ морфологии человека имени академика А.П. Авцына, были получены и успешно апробированы как модели для исследования клеточной патологии при развитии ряда заболеваний, ассоциированных с мутациями мтДНК. Применение таких моделей позволит выявить интересующие связи митохондриальной дисфункции и характера мутаций мтДНК без учета влияния особенностей различных типов клеток. Необходимые для изучения указанных параметров методы исследований в значительной степени отработаны, позволяя при анализе различных моделей получать достоверные количественные результаты с требуемым уровнем детализации – с возможностью оценки функционирования отдельных элементов ЭТЦ, химической природы АФК, источников синтеза АТФ в клетках, распределения и изменения содержания кальция в клеточных компартментах. Реализация проекта будет осуществляться на базе лаборатории клеточной физиологии и патологии, созданной в ФГБОУ ВО «ОГУ имени И.С. Тургенева» в рамках реализации гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в российских образовательных организациях высшего образования, научных учреждениях и государственных научных центрах Российской Федерации № 075-15-2019-1877 от 03 декабря 2019 г. (в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 9 апреля 2010 г. № 220). Данная лаборатория оснащена всем необходимым оборудованием и обеспечивает проведение исследований на международном уровне, включая полный цикл работ с клеточными культурами. Необходимый уровень комплексной оценки состояния митохондрий и связанных с ними внутриклеточных процессов в исследуемых цибридных линиях будет обеспечен использованием гибкого методологического инструментария по одновременному изучению нескольких параметров в физиологических для клеток условиях, включающего флуоресцентную микроскопию, конфокальную микроскопию, в том числе высокого разрешения, полярографию, FRET-анализ. В результате в ходе выполнения проекта будет показана степень зависимости между нарушениями связанной с митохондриями биоэнергетики в цибридных линиях, несущих мутации в генах мтДНК с различной степенью гетероплазмии, а также происходящими при этом изменениями в системах митохондриальной кальциевой сигнализации и редокс-сигнализации, с одной стороны, и патогенезом заболеваний, ассоциированных с рассматриваемыми мутациями, с другой.

Ожидаемые результаты
При реализации проекта планируется получить следующие данные: - статистически достоверная база данных, количественно отражающая зависимость изменений параметров клеточной биоэнергетики от наличия ассоциированных с различными патологиями мутаций мтДНК, учитывающая уровень гетероплазмии и сочетание влияния нескольких типов мутаций мтДНК, локализованных в разных цибридных линиях; - данные о количестве митохондрий в исследуемых цибридах с мутантными формами мтДНК и в контрольных клетках, данные о динамике митохондриальной сети, а именно о степени фрагментации МХ-ретикулума, интенсивности процессовпроцессов слияния и деления митохондрий (Drp1, Mfn1), интенсивности митофагии (оценка LC3, p62, PINK1, Optineurin, Beclin1, BNIP3 и др.) и биогенеза митохондрий (PGC1alpha); - количественные данные об уровне общей продукции АФК и о наличии окислительного стресса и ПОЛ в клетках исследуемых цибридных линий, данные о вкладе различных АФК (H2O2, супероксид) в общую продукцию АФК.; - материалы оценки антиоксидантного статуса исследуемых клеток по уровню восстановленного глутатиона; - данные о содержании ионов кальция в цитоплазме и митохондриях, скорости их перераспределения между клеточными компартментами; - данные оценки влияния генерации АФК и нарушений в развитии кальциевой сигнализации на состояние митохондрий, в том числе на вероятность открывания митохондриальной поры и последующего развития апоптоза. Как показывает анализ публикационной активности в области мутаций мтДНК, большинство исследований проводились на небольшом количестве моделей с ограниченным набором мутаций и/или незначительными вариациями по уровню гетероплазмии. Поэтому ожидаемая в результате выполнения проекта совокупность данных будет обладать уникальностью, связанной с одновременным исследованием двенадцати цибридных линий, несущих десять мутаций мтДНК с различным уровнем гетероплазмии, для восьми из которых показана связь с рядом патологий (см. таблицы 1 и 2 в Файле с дополнительной информацией 1). Это даст основание для разделения патологий при использовании различных молекулярных и клеточных маркеров в качестве классификационных признаков. Прикладное значение полученных результатов связано с использованием для прогнозирования степени риска развития связанных с мутациями в мтДНК заболеваний на основе комплексной оценки параметров состояния митохондрий. Помимо этого, возможно дальнейшее развитие проекта в виде детального рассмотрения механизмов дисфункции митохондрий при исследуемых мутациях с целью определения новых внутримитохондриальных терапевтических мишеней для разработки комплексных средств корректировки патологических состояний, связанных с мутациями в мтДНК.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ