Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Методом флуориметрии утечки кальцеина изучена способность одиннадцати антимикробных циклических липопептидов (акулеацина А, анидулафунгина, каспофунгина, фенгицина, итурина А, микосубтилина, сурфактина, сирингостатина А, сиринготоксина Б, даптомицина и полимиксина Б) ингибировать слияние липидных везикул, включающих нейтральные и отрицательно заряженные фосфолипиды, сфинголипиды и холестерин, под действием ионов кальция, полиэтиленликоля с молекулярной массой 8000 Да и консервативного фрагмента 1 пептида слияния SARS-CoV-2 (816-SFIEDLLFNKVT-827). Выявлено, что некоторые циклические липопептиды способны эффективно подавлять слияние липосом, и их антифузогенная активность зависит от состава мембраны и используемого индуктора слияния. Установлено, что способность подавлять слияние отрицательно заряженных мембран под действием кальция возрастает в ряду: итурин А ≈ сиринготоксин Б < акулеацин А ≈ микосубтилин ≤ анидулафунгин ≈ каспофунгин ≈ фенгицин. При этом, полимер-опосредованное слияние незаряженных липосом эффективно подавляют только акулеацин А, каспофунгин и фенгицин. Каспофунгин, фенгицин, микосубтилин, сирингостатин А и сиринготоксин Б существенно ингибируют слияние сфинголипид-обогащенных мембран под действием фрагмента пептида слияния SARS-CoV-2. С использованием дифференциальной сканирующей микрокалориметрии плавления смеси дипальмитоилфосфохолина и холестерина, а также перехода пальмитоилолеоилфосфоэтаноламина из ламеллярной в инвертированную гексагональную фазу выявлено, что в основе ингибирующего действия циклических липопептидов лежит разупорядочение мембранных липидов и индукция положительной кривизны липидных монослоев. Эффективность наиболее активных соединений, акулеацина А, анидулафунгина, итурина А и микосубтилина, подтверждена с использованием клеточных тест-систем. При инкубировании клеток Vero с акулеацином, итурином А, микосубтилином и анидулафунгином в концентрации 12.5, 50, 12.5 и 6.25 мкг/мл, соответственно, титр вирусного потомства SARS-CoV-2 снижается на 3-4 порядка. Проведено детальное изучение способности одного из циклических липопептидов, полимиксина Б, формировать поры в мембранах, сформированных с участием фосфолипидов и липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Выявлена более высокая кооперативность связывания полимиксина Б с липидными бислоями, включающими Kdo2-липид А, по сравнению с мембранами, включающими отрицательно заряженные фосфолипиды. При изучении влияния формы мембранообразующих липидов на порообразующую способность полимиксина Б выявлено, что антибиотик формирует тороидальные липопептид-липидные поры. Обнаружено, что малые молекулы, уменьшающие дипольный потенциал мембран и индуцирующие положительную кривизну, потенцируют порообразующую активность полимиксина Б и могут быть использованы для разработки его более эффективных лекарственных форм для лечения инфекций, вызванных полирезистентными бактериальными штаммами. В ходе выполнения работ дополнительно проведена оценка возможностей мажорных компонентов экстракта листьев облепихи, а именно, растительных полифенолов, кверцетина, мирицетина и рутина, подавлять слияние отрицательно заряженных липидных везикул под действием кальция. Установлено, что кверцетин и мирицетин ингибируют слияние мембран указанного состава. Рутин подобным эффектом не обладает. Полученные данные позволяют связывать подавление экстрактом листьев облепихи кальций-индуцированного слияния отрицательно заряженных везикул с наличием в его составе кверцетина и мирицетина. Наблюдаемая корреляция между параметрами, характеризующими термотропное поведение дипальмитоилфосфоглицерина в присутствии кверцетина и мирицетина и ингибирование слияния отрицательно заряженных везикул этими флавонолами может указывать на взаимосвязь между их способностью влиять на упаковку мембранных липидов и подавлять слияние везикул. В ходе выполнения проекта также исследовано влияние серии синтетических хромон-содержащих аллилморфолинов на свойства модельных липидных мембран и встроенных в них ионных каналов. Выявлено, что хромонсодержащие аллилморфолины способны изменять дипольный потенциал мембраны и могут быть использованы в качестве дипольных модификаторов. Установлено, что аллилморфолины модулируют проводимость каналов, формируемых антимикробным пептидом грамицидином А, посредством изменения дипольного потенциала мембраны. Также обнаружено, что хромонилаллилморфолины влияют на плотность упаковки мембранных липидов. Последнее согласуется с потенцирующей активностью аллилморфолинов в отношении порообразующей активности антимикробного пептида грамицидина А и противогрибкового макролида амфотерицина Б. С учетом ранее обнаруженного другой группой исследователей антагонизма тестируемых аллилморфолинов в отношении NMDA рецепторов и ацетилхолинэстеразы полученные данные могут стать основой для разработки на основе аллилморфолинов новых препаратов для лечения болезни Альцгеймера. Протестирована способность ряда хромонилаллилморфолинов ингибировать слияние незаряженных везикул под действием полиэтиленликоля с молекулярной массой 8000 Да: установлено, что ингибирование не превышает 10%. Полученные результаты указывают на увеличение скорости слияния липосом в присутствии лантибиотика низина. Дополнительно исследована роль различных фосфолипидов в процессах формирования низином ионных каналов. Обнаружена способность лантибиотика индуцировать ион-проницаемые поры в мембранах, обогащенных диолеилфосфатидилглицерином или кардиолипином. Выраженная порообразующая способность низина в мембранах, содержащих кардиолипин, может быть причиной его высокой противораковой активности. Установлено, что флавоноид флоретин усиливает порообразующую способность низина в кардиолипин-обогащенных мембранах за счет снижения их дипольного потенциала, что может указывать на перспективы разработки комбинированных препаратов, включающих лантибиотик и малые молекулы-модификаторы дипольного потенциала мембран. Выраженное синергетическое действие лантибиотика и флоретина подтверждено значительной деполяризацией мембран митохондрий клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 при совместной инкубации в течение 24-72 часов. По результатам работы в отчетном году опубликовано 3 статьи в зарубежных высокорейтинговых журналах «International Journal of Molecular Sciences» (Q1 по WoS/SJR, IF 6.208), «Antibiotics» (Q1 по WoS/SJR, IF 5.222) и «Membranes» (Q1 по WoS/SJR, IF 4.562), 1 статья в российском издании «Биологические мембраны» (Q4 по WoS/SJR, IF 0.7341) и подана заявка на изобретение «Применение липопептидов в качестве ингибиторов слияния мембран» (№ заявки 2022128914).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе работы дана количественная оценка способности ряда растительных полифенолов ингибировать слияние липидных везикул, включающих отрицательно заряженные липиды и холестерин, под действием ионов кальция. Значимую ингибирующую активность продемонстрировали стильбен пицеатаннол (67%), флаванонол таксифолин (37%), флавонолы кверцетин (85%) и мирицетин (58%), а также флаван-3-ол катехин (22%). Проведен анализ связи структура тестируемых соединений – выраженность их ингибирующего действия. Установлено, что гликозиды полифенолов и агликоны, содержащие от одной до трех гидроксильных групп, не влияют на кальций-опосредованное слияние липидных везикул. Обнаружено, что наличие карбонильной группы и(или) двойной связи в гетероцикле не имеет решающего значения в определении антифузогенной способности флавоноидов. Определяющим фактором является степень гидроксилирования фенольных колец. Так, существенной способностью подавлять слияние мембран характеризуются агликоны полифенолов, имеющих хотя бы две ОН-группы в каждом из фенольных колец, фланкирующих молекулу. Сравнение индексов ингибирования полифенолов, полученных методом флуориметрии слияния липидных везикул, с результатами оценки их влияния на термотропное поведение отрицательно заряженных липидов методом дифференциальной сканирующей калориметрии позволило выдвинуть предположение, что антифузогенное действие полифенолов зависит от глубины погружения молекул в бислой и их ориентации в мембране. Ингибирование слияния мембран, вероятно, обусловлено возникновением напряжения положительной кривизны при адсорбции модифицирующих молекул в гидрофильной области бислоя и их ориентации таким образом, чтобы длинная ось молекулы была параллельна плоскости мембраны. В отчетный период также расширен ряд растительных полифенолов, используемых для скрининга. В ходе этапа изучено влияние флавонов, байкалеина, хризина, вогонина, скутеллареина, апигенина, лютеолина, морина и фисетина, на физико-химические свойства модельных мембран. Показано, что байкалеин увеличивает граничный потенциал нейтральных мембран из диолеоилфосфохолина приблизительно на 40 мВ. Способность снижать трансмембранный скачок потенциала увеличивается в ряду: хризин / скутеллареин (около 50 мВ); апигенин / морин (70-80 мВ); лютеолин / фисетин (более 100 мВ). Вогонин на граничный потенциал фосфатидилхолиновых мембран не влияет. Замена нейтрального диолеоилфосфохолина на отрицательно заряженный диолеоилфосфосерин вызывает двухкратное падение потенциал-модифицирующего эффекта хризина, скутеллареина, апигенина, лютеолина, морина и фисетина, в то время как байкалеин характеризуется более выраженной способностью увеличивать граничный потенциал диолеоилфософсериновых мембран по сравнению с бислоями из диолеоилфосфохолина. Установлено, что модуль падения температуры плавления димиристоилфосфохолина при введении тестируемых флавонов до молярного соотношения липид:модификатор 10 к 1 увеличивается в ряду лютеолин / морин (не более 0.1°C); хризин / вогонин / скутеллареин / апигенин (0.3-0.4°C); байкалеин / фисетин (0.6-0.7°C). При этом байкалеин, хризин, скутеллареин, апигенин и фисетин также вызывают значительное падение кооперативности фазового перехода, что выражается в увеличении ширины основного пика на термограмме на 0.5-1.2°C. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженном разупорядочивающем действии байкалеина, хризина, скутеллареина, апигенина и фисетина на нейтральные мембраны. Изучение влияния растительных флавонов на термотропное поведение отрицательно заряженных липидов и оценка их антифузогенного потенциала запланированы на следующий год. По результатам работы в отчетном году опубликовано 3 статьи в зарубежных высокорейтинговых журналах «Nutrients» (Q1 по WoS/SJR, IF 5.9), «Antiviral Research» (Q1 по WoS/SJR, IF 7.6) и «Antibiotics» (Q1 по WoS/SJR, IF 4.8), получен патент на изобретение (RU 2802823, 04.09.2023), а также защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.