КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-15-00483
НазваниеИсследование коннектомов раковых опухолей для идентификации нового типа терапевтических мишеней - контактов раковых клеток с окружающей стромой
РуководительАлексеенко Ирина Васильевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология
Ключевые словаМетастазирующий рак, клеточные взаимодействия, опухоль-ассоциированные фибробласты, транскриптом, молекулы адгезии, онкогенные синапсы, геномное редактирование
Код ГРНТИ76.00.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Солидные опухоли секретируют в кровоток большое количество высокогетерогенных циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Однако, только небольшая часть циркулирующих опухолевых клеток может выжить и в конечном итоге дать начало новой опухоли. Эффективное метастазирование (> 90%) ассоциировано с комплексами опухолевых клеток, иногда называемыми циркулирующими микроэмболиями опухоли, определяемыми как группы из двух или более ЦОК. В то время как отдельные ЦОК могут испытывать проблемы с выживанием, такие как окислительный стресс и иммунные эффекты, ведущие к апоптозу, ЦОК в комплексах остаются защищенными. Максимальным метастатическим потенциалом обладают опухолевые комплексы, содержащие опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ), которые обеспечивают микросреду, благоприятную для выживания раковых клеток. Роль ОАФ в метастазировании широко изучена. Показано, что взаимодействия между ОАФ и раковыми клетками способствуют инвазии и метастазированию. ОАФ способны индуцировать образование метастазирующих опухолевых комплексов в том числе посредством белков межклеточной адгезии.
Впервые метастазирующие опухолевые комплексы были найдены в асцитах пациенток с карциномой яичников. Находясь в брюшной полости, раковые клетки объединяются со свободно плавающими клетками миофибробластов, образуя гетеротипические комплексы. Это позволяет раковым клеткам выживать и приобретать более инвазивный фенотип.
Несмотря на многочисленные исследования межклеточных взаимодействий в опухоли, механизмы взаимодействия ОАФ с раковыми клетками во время их коллективной миграции все еще далеки от понимания. В частности, остается нетронутым вопрос о том, формируются ли во время метастазирования кластеры взаимодействий (синаптоподобные структуры) между раковыми клетками и ОАФ и какие гены участвуют в их формировании.
В ходе данного проекта будет предпринята попытка идентификации кластеров (синапсоподобных структур) взаимодействий раковых клеток и ОАФ при их совместном метастазировании, а также поиск возможностей для их разрушения. Идентификация синаптоподобных структур и генов, участвующих в их образовании, может дать начало новым подходам к лечению рака, разрушающим эти кластеры. Такие подходы смогут дополнить терапию с использованием иммунных контрольных точек, которая также направлена на нарушение взаимодействий между раковыми клетками и клетками иммунной системы.
В проекте будут использованы самые современные методы молекулярной биологии: омиксные технологии (транскриптомный и протеомный анализ), методы геномного редактирования (в том числе CRISPR-Cas), конфокальная микроскопия, биоинформатический анализ (в том числе подход Connectivity Map).
Исследование будет выполняться на раковых клетках и ОАФ, полученных из первичных и вторичных опухолей пациентов, в условиях in vitro (ко-культуры раковых клеток и ОАФ) и in vivo (ксенографтные опухолевые модели на nude/с мышах).
В рамках данного проекта планируется решить следующие задачи:
1. На основе опубликованных данных транскриптомного и протеомного анализа циркулирующих в крови опухолевых комплексов выбрать поверхностные белки – кандидаты на роль посредников во взаимодействиях раковых и стромальных клеток в метастазирующих комплексах
2. Выделить раковые клетки из первичных опухолей и метастатических очагов пациентов с метастатическим раком. Провести сравнительный транскриптомный анализ раковых клеток из первичных очагов и из метастазов с целью выявления ключевых белков, осуществляющих взаимодействия между раковыми и стромальными клетками
3. Провести поиск кластеров (синаптоподобных структур) в 3D ко-культурах выделенных из опухолей раковых и стромальных клеток с помощью конфокальной микроскопии. Определить белковый состав найденных кластеров с помощью масс-спектрометрии.
4. Получить раковые клетки, в которых экспрессия выявленных генов, ответственных за образование кластеров, будет подавлена с помощью технологии геномного редактирования или генного нокдауна. Провести транскриптомный анализ, а также функциональные тесты подвижности и инвазивности нативных и полученных вариантов раковых клеток. Отобрать те гены, инактивация которых будет связана со снижением способности раковых клеток взаимодействовать с ОАФ и снижением их метастатического потенциала
5. Сравнить метастатический потенциал нативных и модифицированных раковых клеток путем прививания раковых клеток иммунодефицитным мышам. Это позволит выбрать гены кластеров, подавление которых оказывает наибольшее влияние на метастатический потенциал раковых клеток.
6. При помощи биоинформатического анализа, в том числе подхода Connectivity Map, предсказать препараты, оказывающие сходный с подавлением экспрессии выявленных генов эффект на раковые клетки.
7. В экспериментах in vitro провести сравнение эффектов предсказанных препаратов и подавления экспрессии выявленных генов на подвижность и инвазивность раковых клеток, а также на их способность взаимодействовать с фибробластами. Влияние таких препаратов на формирование кластеров между раковыми клетками и ОАФ будет изучено с помощью конфокальной микроскопии.
Таким образом, в ходе проекта не только будут получены новые фундаментальные знания о раково-стромальных взаимодействиях, но также будут получены данные о влиянии изменений этих взаимодействий на прогрессию опухоли. Впервые будет проведена прямая проверка гипотезы о существовании синаптоподобной структуры между раковыми клетками и ОАФ. Такая информация может послужить основой для разработки новых или усовершенствования имеющихся терапевтических подходов, направленных на микроокружение опухоли.
Ожидаемые результаты
В ходе выполнения данного проекта будет предпринята попытка структурного и функционального анализа кластеров прямых взаимодействий раковых клеток и ОАФ при их совместном метастазировании, а также поиск подходов для их разрушения.
Для этого, на основе опубликованных данных NGS циркулирующих в крови опухолевых комплексов, а также полученных в проекте данных NGS метастазирующих опухолей пациентов, будут выбраны поверхностные белки – кандидаты на роль посредников во взаимодействиях раковых и стромальных клеток в метастазирующих комплексах. В 3D ко-культурах выделенных из опухолей раковых и стромальных клеток с помощью конфокальной микроскопии будет произведен поиск синаптоподобных структур (кластеров молекул), в состав которых входят выбранные белки-кандидаты. В случае нахождения таких межклеточных образований будет проведен анализ их белкового состава с помощью масс-спектрометрии. На основе полученных таким образом данных будут выбраны белки-кандидаты для последующей оценки их роли во взаимодействиях раковых клеток с ОАФ и метастазировании. Будут получены модифицированных клеточные линии раковых клеток, в которых экспрессия генов этих белков будет выключена с помощью технологии геномного редактирования или подавлена с помощью стабильного нокдауна. Далее будут получены транскриптомы модифицированных и нативных линий раковых клеток, кроме того, будут охарактеризованы подвижность и инвазивность этих линий. Помимо этого будет оценен метастатический потенциал нативных и модифицированных линий путем прививания раковых клеток иммунодефицитным мышам. На основании транскриптомных данных и функциональных тестов, будут отобраны гены, инактивация которых будет связана со снижением способности раковых клеток взаимодействовать с ОАФ и снижением их метастатического потенциала. Это позволит выбрать гены поверхностных белков-кандидатов, подавление которых оказывает наибольшее влияние на метастатический потенциал раковых клеток. Затем, при помощи биоинформатического анализа, в том числе подхода Connectivity Map, будут предсказаны препараты, оказывающие сходный с подавлением экспрессии выявленных генов эффект на раковые клетки. Наконец, будет проведено сравнение эффектов предсказанных препаратов и подавления экспрессии выявленных генов на подвижность и инвазивность раковых клеток, а также на их способность взаимодействовать с фибробластами в экспериментах in vitro. Влияние таких препаратов на формирование кластеров между раковыми клетками и ОАФ будет изучено с помощью конфокальной микроскопии.
Таким образом, в ходе проекта не только будут получены новые фундаментальные знания о раково-стромальных взаимодействиях, но также будут получены данные о влиянии изменений этих взаимодействий на прогрессию опухоли. Впервые будет проведена прямая проверка гипотезы о существовании синаптоподобной структуры между раковыми клетками и ОАФ. Такая информация может послужить основой для разработки новых или усовершенствования имеющихся терапевтических подходов, направленных на микроокружение опухоли. В дальнейшем могут быть созданы новые противоопухолевые препараты, ингибирующие выявленные в ходе выполнения проекта проопухолевые взаимодействия. Такие препараты могут обеспечить снижение устойчивости солидных опухолей к стандартному лечению, а также принести значительный социальный и экономический эффект: повысить эффективность противоопухолевой терапии, снизить количество операционных вмешательств у больных, улучшить прогноз и, в конечном итоге, продолжительность жизни пациентов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения данного проекта будет предпринята попытка структурного и функционального анализа кластеров прямых взаимодействий раковых клеток и клеток опухолевого микроокружения, способствующего опухолевой прогрессии, а также поиск возможностей для их разрушения.
На первом этапе работы был проведен литературный и биоинформатический анализ существующих данных NGS циркулирующих в крови раково-стромальных комплексов (РСК) и создан перечень выявленных лиганд-рецепторных взаимодействий, способствующих кластеризации РСК и метастазированию. В связи с тем, что дальнейшая работа по Проекту будет выполняться на клеточных культурах, были дополнительно проанализированы кокультуры на предмет встречаемости выявленных взаимодействий. Созданы списки выявленных пар лиганд-рецепторных взаимодействий, экспрессия которых после кокультивирования выше пороговых значений.
Помимо этого, проводился дополнительный биоинформатический анализ дифференциально экспрессируемых генов в парах до/после кокультивирования среди клеток опухоли и микроокружения. Среди сверхэкспрессированных после кокультивирования генов, связанных с мембранными белками и белками внеклеточного матрикса в опухолевых клетках (1029 генов) было обнаружено 157 генов, кодирующих рецепторы и 203 гена, кодирующих лиганды; в фибробластах (471 ген) обнаружено 110 генов, кодирующих рецепторы и 106 генов, кодирующих лиганды. Всего было идентифицировано 138 пар рецептор-лиганд. Полученные в результате анализа данные будут использованы на следующих этапах работы.
Подготовлен пакет документов для сбора биообразцов опухолей человека. Подготовленный пакет документов был рассмотрен и одобрен Локальным этическим комитетом при ГБУЗ МКНЦ им. А.С. Логинова ДЗМ. Всего собрано 22 опухолевых образца рака молочной железы и поджелудочной железы: 12 образцов первичной опухоли и 10 образцов метастатических очагов.
Был проведен анализ литературы по диссоциации опухолевых тканей, и, после экспериментальной корректировки создан протокол получения клеточных суспензий из опухолевых образцов. Для выделения из опухолевой суспензии популяций раковых, иммунных клеток и опухоль-ассоциированных фибробластов подобрана панель антител для детекции следующих маркеров: CD326 (эпителиальные раковые клетки), CD45 (иммунные клетки) и CD31 (эндотелиоциты), CD90 (опухоль-ассоциированные фибробласты). Все полученные опухолевые образцы (22) были процессированы и далее разделены на опухолевые популяции с помощью проточного проточного цитофлуориметра-сортировщика клеток BD FACSAria III (BD Biosciences).
Для опухолевых образцов были получены целевые опухолевые популяции - CD326+СD45-CD31- (раковые клетки), СD90+CD326-СD45-CD31- (опухоль-ассоциированные фибробласты), CD45+CD326- (иммунные клетки). Была отработана методика по получению первичных культур из опухолевых образцов. Был подобран оптимальный состав питательной среды, подходящей для культивации первичных культур. Показано, что возможно получение целевых популяций из первичных культур при применении стратегии высева тотальной опухолевой суспензии с последующей сортировкой. Из 11 биологических образцов опухоли были получены четыре первичные культуры, которые дали конфлюэнтный монослой, что соответствует возможному выходу первичных линий из опухолевых образцов (13-30% согласно литературным данным) Получено 44, амплифицированных с помощью ПЦР библиотек кДНК с двухсторонними индексами (20 библиотек из раковых и, 20 библиотек из стромальных опухолевых клеток, 4 библиотеки из первичных культур), предназначенных для секвенирования на платформе Illumina. Полученные библиотеки кДНК подготовлены для секвенирования по технологии Illumina NovaSeq 6000.
Далее будет проведен сравнительный транскриптомный анализ с целью выявления ключевых поверхностных белков, отвечающих за формирование проопухолевых взаимодействий и прогрессию опухоли. Такие молекулы в дальнейшем могут стать новой терапевтической мишенью для лечения агрессивных типов опухолей.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения Проекта в 2023 году были предприняты попытки визуализации кластеров прямых взаимодействий раковых клеток и клеток опухолевого микроокружения, а также проведен функциональный анализ таких взаимодействий.
Было проведено секвенирование библиотек кДНК из популяций клеток, полученных из образцов опухолей пациентов, проведен анализ данных RNA-seq и определены возможные поверхностные белки, способные осуществлять взаимодействия между раковыми и стромальными клетками (ПБК-РСК - поверхностных белков, способных осуществлять взаимодействия между раковыми и стромальными клетками). Полученные кандидатные белки сравнили со списком ПБК-РСК, выбранными при биоинформатическом анализе открытых источников, выполненном в предыдущем году работы по Проекту. Среди проанализированных парных взаимодействий ПБК-РСК, были найдены две пары белков, обнаруженные в результате предыдущем анализе в рамках Проекта – FADD_ABCA1 и PODXL2_SELL (Rozenberg, 2023; doi: 10.3389/fimmu.2023.1099921). При ранжировании наших данных по ТРМ, очень высокая представленность была обнаружена для генов CD44 и ICAM1 в некоторых образцах. Эти гены ранее были нами выбраны как потенциальные ПБК-РСК на основании высокой экспрессии в РК.
Получены трехмерные монокультуры РК и кокультуры раковых клеток с ОАФ (опухоль ассоциированные фибробласты). Для выявления кластеров/синаптоподобных структур ПБК-РСК был использован метод формирования 3Д моделей сфероидов в различных условиях. Показано, что в кокультуре MCF7/ОАФ плотности сигналов CD62L и CD44 слегка повышены по отношению к моносфероидам MCF7. А для сфероидов MCF7/ОАФ уровень сигнала FADD на порядок выше чем в моносфероидах. Таким образом, в условиях геторосфероидов ОАФ/РК мы можем наблюдать усиление экспрессии некоторых исследуемых ПБК-РСК, что в определенной степени согласуется с нашим предположением, что для таких генов крайне важно взаимодействие ОАФ/РК.
Таким образом, в полученных трехмерных кокультурах раковых клеток с ОАФ показано преимущественное формирование скоплений ПБК-РСК, по отношению к моносфероидам. Что позволяет делать нам предположение о важности взаимодействий РК-ОАФ, для ПБК-РСК, возможная роль таких взаимодействий будет исследована далее.
В раковых клеточных линиях MCF7 и MDA-MB231 было проведено подавление экспрессии генов CD44, ICAM1, CD44/ICAM1, с использованием трансфекции с siRNA. После проведения трансфекции клеток проводили проточную цитометрию, для определения уровня подавления гена CD44. Проведение проточной цитометрии осуществляли на проточном цитометре-сортировщике BD FACSAriaIII. Уровень подавления составлял около 50% по MFI. В случае использования siRNA CD44/ICAM1 наблюдали дозозависимое уменьшение подавления CD44 относительно подавления только siRNA CD44.
Проведены функциональные тесты подвижности нативных и модифицированных раковых клеток методом scratch assay (тест зарастания царапины), с in silico обработкой данных. Для этого, клетки линий MCF7 и MDA-MB231 с подавленной экспрессией генов CD44, ICAM1, CD44/ICAM1, и контрольные клетки высевали на специально размеченные 6 луночные планшеты. После появления конфлюэтного монослоя, проводили царапину, которую фотографировали до полного зарастания. С фотографий, полученных в результате проведения scratch test, были получены численные данные о скорости зарастания царапины. Для этих целей был написан макрос, позволяющий целиком обрабатывать серию фото, в программе ImageJ. После обработки фото, программа заносила снятые данные в Excel. За единицу (100%), принимали полную конфлюэнтность – полное зарастание царапины. Также были посчитаны среднеквадратичные отклонения всех значений для обозначения погрешностей результирующих данных. Таким образом, все изображения были переведены в цифровые значения, с соответствующими значениями S.E.M. Результирующие кривые зарастания показали, что наиболее длительное зарастание характерно для двойного ингибирования CD44/ICAM1.
Для определения влияния эффекта подавления экспрессии генов ПБК-РСК на способность раковых клеток взаимодействовать с ОАФ, были проведены аналогичные функциональные тесты подвижности нативных и раковых клеток с подавленной экспрессией ПБК-РСК в присутствии ОАФ. Показано, что именно ОАФ, первыми заполняют царапину. При этом сильно увеличивается время зарастания царапины как для клеток с подавленной экспрессией ПБК-РСК, так и для нативных клеток. Разница между siRNA+ и Контролем, сильно сглаживается, хотя, siRNA+ подавление увеличивает время зарастания царапины.
Мы предположили, что отбор генов, подавление которых приводит к наибольшему снижению метастатического потенциала может осуществляться из пула исследованных ПБК-РСК. Соответственно выявление сигнальных путей, ответственных за взаимодействие со стромальными клетками может быть выявлено при анализе пула ингибиторов ПБК-РСК: сигнальные пути которые ингибируют несколько ПБК-РСК, могут быть эффективным подходом для разработки новых антиметастатических стратегий.
Публикации
1. Антонова Д.В., Гнатенко Д.А., Котова Е.С., Плешкан В.В., Кузьмич А.И., Свердлов Е.Д., Алексеенко И.В. Cell-specific expression of the FAP gene is regulated by enhancer elements Frontiers in Molecular Biosciences, 2023 Feb 7;10:1111511. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fmolb.2023.1111511
2. Плешкан В.В., Зиновьева М.В., Антонова Д.В., Алексеенко И.В. Spheroids of FAP-Positive Cell Lines as a Model for Screening Drugs That Affect FAP Expression Biomedicines, Biomedicines 2023, 11(7), 2017 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biomedicines11072017
3. Алексеенко И.В., Кондратьева Л.Г, Чернов И.П., Свердлов Е.Д. From the Catastrophic Objective Irreproducibility of Cancer Research and Unavoidable Failures of Molecular Targeted Therapies to the Sparkling Hope of Supramolecular Targeted Strategies International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2023, 24(3), 2796 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24032796
4. Розенберг Ю.М., Буздин А.А., Мохаммад Т., Ракитина О.А., Дидыч Д.А., Плешкан В.В., Алексеенко И.В. Molecules promoting circulating clusters of cancer cells suggest novel therapeutic targets for treatment of metastatic cancers Frontiers in Immunology, 2023 Mar 15;14:1099921. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1099921