Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект нацелен на изучение факторов чувствительности и резистентности к иммунотерапии, выявление особенностей иммунологической реконституции у пациентов детского возраста и подростков с острыми лейкозами, прошедших алло-ТГСК. 1) Ретроспективный анализ потери гетерозиготности по генам HLA на опухолевой популяции у детей и подростков в возрасте от 0 до 21 лет с рецидивом острого лейкоза после алло-ТГСК Мы проанализировали 83 образца ДНК от 79 пациентов детского возраста с костно-мозговым рецидивом острого лейкоза после алло-ТГСК на предмет потери гетерозиготности HLA путем сравнения высокополиморфных микросателлитных маркеров (STR), включавшим исследование 6 STR-локусов: D6S473, D6S291, D6S273, D6S265, D6S105, D6S277. Пациенты имели следующие диагнозы: В клеточный острый лимфобластный лейкоз (n=40), Т клеточный острый лимфобластный лейкоз (n=9), острый лейкоз со смешанный фенотипом – Т/миело (n=1), острый миелоидный лейкоз (n=22), ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (n=7). Четверо пациентов были проанализированы дважды: после первой алло-ТГСК и после повторной ТГСК. Всего 77 случаев были включены в анализ после первой ТГСК, 6 случаев после повторной ТГСК. Потеря гетерозиготности по генам HLA была обнаружена у 22/79 пациентов (28%): 7/40 пациентов с В-ОЛЛ (18%), 4/9 (44%) пациентов с Т-ОЛЛ, 6/22 (27%) пациентов с ОМЛ, 5/7 (71%) пациентов с ЮММЛ. У 13/22 (59%) пациентов обнаружена потеря гетерозиготности по генам HLA I класса, у 9/22 (41%) – по генам HLA I и II классов. После первой алло-ТГСК потеря гетерозиготности HLA была обнаружена у 17/77 пациентов (22%), и более часто наблюдалась у пациентов после повторной ТГСК – у 5/6 (83%) пациентов, p=0.001. Медиана времени развития рецидива с потерей составила 8 месяцев после ТГСК (2-17 месяцев), медиана времени развития рецидива без потери HLA составила 5 месяцев (1-30 месяцев), p=0.072. Для группы пациентов с диагнозом ОЛЛ была выявлена взаимосвязь клинически значимых форм РТПХ с риском развития потери гетерозиготности HLA. У 5 из 11 (45%) пациентов с найденной потерей гетерозиготности по генам HLA наблюдалась РТПХ, в то время как в группе с классическим типом рецидива – лишь у 5 из 33 пациентов (15%), p=0.033. Для пациентов с ОМЛ факторами, ассоциированными с потерей HLA в рецидиве стали: выполнение ТГСК вне 1-2 ремиссии заболевания (p=0.05), большее число линий предшествующей терапии (p=0.004), а также персистенция МОБ после алло-ТГСК (p=0.032). Результаты данного анализа поданы в качестве тезисов на ежегодную конференцию: The 49th Annual Meeting of the European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT 2023). Также с помощью NGS секвенирования было выполнено HLA типирование по 6 генам (А,В,С, DQB1, DRB1,DPB1) 4х образцов ДНК, в которых ранее была найдена потеря гетерозиготности HLA методом STR. Во всех анализируемых образцах четко обнаруживался общий гаплотип, характерный для реципиента и донора. Собственный гаплотип при этом не определялся. При химеризме 20% -30 % порция донорского гаплотипа была снижена относительно общего гаплотипа. Таким образом была подтверждена потеря гетерозиготности по гаплотипу реципиента. 2) Проспективный анализ потери гетерозиготности по генам HLA у детей, наблюдающихся в клинике НИИ ДОГиТ с подтвержденным костномозговым или комбинированным рецидивом после алло-ТГСК. Начата проспективная оценка потери гетерозиготности по генам HLA методом STR 6 локусов. Проанализированы 3 пациента, находящихся на лечении в НИИ ДОГиТ: 2 пациента с ОЛЛ и 1 пациент с ОМЛ. Материалом для анализа стала сортированная методом проточной цитометрии популяция бластных клеток исходя из данных иммунофенотипа определенного в дебюте заболевания. Потеря гетерозиготности HLA не была обнаружена в данных случаях. 3) Проспективный анализ субпопляционного состава Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+ наивные, центральной памяти, эффекторной памяти, эффекторы, TCR альфа/бета и гамма/дельта фракции) и NK-клеток (CD3-CD16+, CD56+) у детей, получающих профилактические ИДЛ. Начата проспективная оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии у пациентов, получающих инфузии донорских лимфоцитов. Анализируемыми клеточными популяцими стали: CD3+, CD4+, CD8+, наивные (CD45RA+,СD197+), центральной памяти (CD45RA-,СD197+), эффекторы (CD45RA+,СD197-), эффекторной памяти (CD45RA-,СD197-.), NK-клеток (CD3-CD16+, CD56+). У 21 пациента была выполнена оценка субпопуляционного состава до первого введения ИДЛ (30-150 день после ТГСК). К настоящему моменту из них 16 пациентов получили профилактическое введение ИДЛ. Медиана введения первой дозы составила Д+112 (70-200). Медиана начальной дозы составила 1*106 по CD3+/кг (1*105-1*106). У 14 пациентов выполнен анализ субпопуляционного состава лимфоцитов после первого введения ИДЛ с медианой 55 дней после первой инфузии (31 -87 дней). Мы сравнили относительные значения субпопуляционного состава в % от ЯСК в двух точках: до первого введения ИДЛ и после первого введения ИДЛ – с помощью критерия Уилкоксона. Было отмечено значимое увеличение относительного содержания фракций naïve популяций T-лимфоцитов (naïve CD4+, CD8+) после начала иммуноадоптивной терапии. Медиана naïve T CD4 0.5% до первой ИДЛ в сравнении с 1.5% после первого введения ИДЛ, p=0.02. Медиана naïve T CD8 0.3% до ИДЛ против 0.8% после ИДЛ, p=0.02. Также начата проспективная оценка субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов, получающих комбинированную иммуноадоптивную терапию с применением ИДЛ и биспецифического активатора Т-клеток Блинатумомаба. К настоящему моменту включены 6 пациентов, у которых проведена оценка субпопуляционного состава до и после начала терапии. Результаты комбинированной иммуноадоптивной терапии у детей с ОЛЛ с использованием Блинатумомаба и ИДЛ отражены в опубликованной нами работе в журнале Cellular therapy and Transplantation на сайте http://www.cttjournal.com/upload/iblock/822/ctt_2022_11_2_pg31_38_tsvetkova.pdf, а также приняты к публикации данные по иммунотерапии при младенческом ОЛЛ в журнал Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект нацелен на изучение механизмов иммунологической резистентности у детей с острыми лейкозами после алло-ТГСК. Во второй отчетный период он включал в себя работы по следующим направлениями: 1) Завершение ретроспективной части изучения феномена потери гетерозиготности по генам HLA и определение его клинической значимости у детей с рецидивом острого лейкоза после алло-ТГСК. Данный этап включал в себя применение системы HLA-KMR (GenDX, Нидерданды) и метода STR. Для 28 пациентов с уже установленной потерей HLA методом STR, для 8 пациентов (28,5%) был найден соответствующий HLA KMR - маркер. Были проанализированы пробы в момент развития рецидива, а также пробы, предшествующие развитию рецидива. Мы не выявили существенных различий в выявлении HLA LOH в посттрансплантационном периоде как при использовании подхода, основанного на анализе STR локусов, так и на основе коммерческой тест-системы. При этом методом HLA-KMR была возможна более ранняя детекция потери HLA гаплотипа в пробах с полным донорским химеризмом. В ретроспективный анализ HLA KMR были также включены пациенты с МОБ или рецидивом при наличии полного донорского химеризма. Всего включено было 14 детей, однако информативный HLA маркер был подобран лишь у 7 пациентов (50%). Ни у одного из 7 пациентов не было обнаружено потери HLA. Была проведена оценка прогностического значения обнаружения HLA LOH при рецидиве заболевания после алло-ТГСК. Проведен сравнительный анализ ОВ и последующей БРВ 61 пациента с первым рецидивом после гапло-ТГСК, из них 18 (29%) имели зафиксированную потерю гетерозиготности генов HLA, 43 (71%) не имели HLA LOH. При медиане наблюдения 6 (0,1-68) мес БРВ с момента первого рецидива до прогрессии/следующего рецидива заболевания значимо не различалась между группами и составила 16% в группе с потерей HLA-гаплотипа и 23% в группе без потери HLA-гаплотипа. Медиана БРВ составила 1,7 мес в группе с потерей HLA-гаплотипа и 2,5 мес в группе без потери HLA-гаплотипа, р = 0,25. ОВ при медиане наблюдения 6 мес составила 22% в группе с потерей HLA-гаплотипа и 37% в группе без потери HLA-гаплотипа. Медиана ОВ - 4,5 мес и 10,3 мес соответственно, р = 0,063. Прогноз пациентов с потерей HLA-гаплотипа был крайне неблагоприятным. Наилучшую выживаемость среди пациентов с потерей гаплотипа имели дети, прошедшие повторную аллогенную ТГСК со сменой донора. Потеря HLA-гаплотипа в педиатрической когорте пациентов с острыми лейкозами имеет большое значение для определения прогноза и дальнейшей терапевтической стратегии при рецидиве заболевания, https://www.hemoncim.com/jour/article/view/723/595. Впервые был проведен ретроспективный анализ HLA LOH у пациентов с ЮММЛ. Оценка HLA LoH методом STR была проведена у 12 (85%) из 14 пациентов с рецидивом после алло-ТГСК. LoH HLA выявлена у 4 из 12 (33%) пациентов. У 2/4 пациентов был также применен метод HLA KMR. Терапия ИДЛ была проведена трем пациентам, после чего у всех больных развилась острая РТПХ. Однако эффекта на иммуноадоптивную терапию достигнуто не было. Всем пациентам с HLA LoH была проведена повторная алло-ТГСК: двоим– со сменой донора, двоим- без смены донора. Ремиссия заболевания была подтверждена у 2 пациентов после повторной алло-ТГСК со сменой донора. У 2 пациентов, которым была проведена вторая алло-ТГСК без смены донора, ремиссии заболевания не было достигнуто, и пациенты погибли от прогрессии заболевания. Таким образом, наше наблюдение дает представление о важности изучения HLA LOH у пациентов с ЮММЛ для определения показаний к проведению иммунотерапии и повторной алло-ТГСК, https://www.hemoncim.com/jour. 2) Проспективное изучение механизмов потери HLA с помощью комбинированного диагностического подхода с использованием метода STR, коммерческой системы HLA-KMR (GenDX, Нидерданды) и метода проточной цитометрии, направленного на анализ экспрессии HLA I и II классов на поверхности бластной популяции. Была расширена панель анализируемых STR фрагментов до 12 локусов, расположенных на коротком плече 6 хромосомы: D6S265, D6S473, D6S277, D6S105, D6S273, D6S291, D6S2674, D6S2675, D6S2664, D6S2876, D6S2661 и D6S2444. Всего в течение отчетного года проспективный анализ методом STR был выполнен у 19 пациентов: 13 пациентов с В-ОЛЛ, 1 пациент с Т-ОЛЛ, 3 пациента с ОМЛ, 1 пациент со смешанным фенотипом Т/миело, 1 пациент с рецидивом ЮММЛ. У 6/19 пациентов была выявлена потеря HLA. Проспективный анализ HLA LOH HLA-KMR был выполнен 2м пациентам: один пациент имел персистенцию МОБ, один пациент – снижение уровня донорского химеризма. В обоих случаях потери HLA диагностировано не было. Начата проспективная оценка экспрессии HLA на поверхности бластной популяции с использованием моноклональных антител к HLA I классу (HLA-A,B,C, FITC) и HLA II классу (HLA- DR,DP,DQ, PE) методом проточной цитометрии. Оценка экспрессии HLA была выполнена 17 пациентам: 14 пациентов с В-ОЛЛ, 1 пациент с Т-ОЛЛ, 1 пациент с ОМЛ, 1 пациент с острым лейкозам со смешанным фенотипом Т+миело. Первичная диагностика экспрессии HLA при постановке диагноза проведена 3 пациентам, в рецидиве заболевания перед алло-ТГСК – 4 пациентам, в рецидиве заболевания после алло-ТГСК- 10 пациентам. Инициально и до алло-ТГСК все пациенты имели 100% экпрессию HLA I и II классов. После алло-ТГСК у 5/10 пациентов имели отсутствие/снижение экспрессии HLA. После сортировки бластной популяции и оценки методом STR потеря гетерозиготности HLA I и II класса была подтверждена у 2 пациентов с отсутствием экспрессии HLA I класса. У остальных пациентов HLA LOH выявлено не было. 3) Проспективное изучение субпопуляций Т-клеток ( CD3+, CD4+, CD8+ наивные, центральной памяти, эффекторной памяти, эффекторы, Т-регуляторные клетки, ) NK-клеток (CD3-CD16+, CD56+), супрессорных клеток миелоидного происхождения, ко-ингибирующих рецепторов (PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3) с помощью проточной цитометрии. Всего в течение отчетного года субпопуляционный состав Т-лимфоцитов был проанализирован у 48 пациентов (51 проба), анализ Т-регуляторных клеток - у 17 пациентов (19 проб). Мы сравнили между собой субпопуляционный состав 3х групп пациентов: 1. Проба до Д+100 до начала терапии ИДЛ (n=40) 2. Проба Д+100-Д+180 у пациентов, не получивших раннее введение ИДЛ (n=19). 3. Проба Д+120-Д+180 у пациентов, получивших раннее введение ИДЛ (n=11), Было выявлено значимое увеличение субпопуляции CD8+ наивных Т-клеток в группе пациентов, получивших раннее введение ИДЛ в сравнении с пациентами, не получившими раннее введение ИДЛ (группы 2 и 3), p=0.046. Таким образом, можно предположить о влиянии ранней ИДЛ на иммунологическую реконституцию наивных Т-клеток, являющихся главным источником Т-клеточного репертура и обеспечивающих противоинфекционный и противоопухолевый эффект. Начато изучение супрессивного микроокружения костного мозга: супрессорные клеток миелоидного происхождения (полиморфно-ядерных, моноцитарных, ранних), а также М2 макрофагов (CD163+CD206+). Всего было проанализировано 64 пробы. С целью определения значения экспрессии ко-ингибирующих молекул у детей при остром лимфобластном лейкозе была отобрана группа, состоящая из 25 пациентов с В-ОЛЛ. У 11 пациентов не наблюдалось развития рецидива после алло-ТГСК, медиана времени забора пробы составила 42 дня после алло-ТГСК (Д+30-Д+200). Медиана наблюдения после алло-ТГСК в этой группе составила 9 месяцев (3-14 мес.). У 14 пациентов проба была забрана после развития рецидива заболевания/МОБ. Медиана времени развития рецидива составила 213 дней после алло-ТГСК (Д+25-Д+1099). Медиана времени забора материала составила 152 дней после алло-ТГСК (Д+70-Д+1101), p=0.01. При сравнении абсолютных значений уровня экспрессии молекул контрольных точек было выявлено значимое увеличение числа лимфоцитов и Т-клеток, экспрессирующих TIM-3 у пациентов с рецидивом заболевания после алло-ТГСК, p=0.00052, P=0.025. При этом не было выявлено различий в количестве клеток, экспрессирующих CTLA-4, PD-1, LAG3. Таким образом, экспрессия TIM3 может быть ассоциирована с истощенным Т-клеточным фенотипом при В-ОЛЛ. Для уточнения роли данного рецептора в прогнозе рецидива после алло-ТГСК планируются дальнейшие исследования.