Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью проекта является изучение биосовместимости наночастиц ОГ с клетками иммунной системы. Для реализации проекта использовали наночастицы ОГ с латеральными размерами 100-200 нм (ОГм) и 1-5 мкм (ОГб) были функционализированные ПЭГ (П-ОГ), полимером, способным улучшать коллоидную стабильность и профиль токсичности наноматериалов. Для покрытия наночастиц использовали два типа ПЭГ, а именно линейный и разветвленный (8-разветвлённый ПЭГ), что основано на литературных данных, предполагающих, что разветвленная форма может обеспечивать лучшую стабильность в жидкости культивирования клеток [Xu, 2014]. В рамках 2022 годы было проведено определение метаболических изменений в клетках в процессе взаимодействия с наночастицами ОГ В работе были использованы следующие биологические объекты – клеточные линии Jurkat, THP-1 и гибридома BAP3 как представители патологически измененных клеток, в противовес применялись нормальные клетки иммунной системы человека (Т-лимфоциты, Т-хелперы, моноциты, дендритные клетки, нейтрофилы). В данных клетках оценивали метаболизм клеток (митохондириальное дыхание, гликолиз), а в серии параллельных экспериментов также жизнеспособность и поглощение наночастиц под воздействием наночастиц ОГ. Установлено, что наночастицы пегилированного ОГ не влияли на жизнеспособность сепарированных СD3+-и CD4+клеток, и не демонстрировали адгезии/интернализации, однако модулировали метаболизм этих клеток. Так, в Т-лимфоцитах и Т-хелперах скорость поглощения кислорода и уровень АТФ-связанного дыхания увеличивалась под воздействием высокой концентрации ОГ-ПЭГм (25 мкг/мл), Интенсивность гликолиза повышалась в присутствии частиц в высокой концентрации. В противовес Т-клетками, Jurkat не отвечали на внесение наночастиц графена усилением митохондриального дыхания, но было показано повышение интенсивности гликолиза. При изучении влияния наночастиц ОГ на клетки гибридомы BAP3 было показано, что частицы оказывали цитотоксический эффект в высокой концентрации (25 мкг/мл), а также были способны к адгезии/интернализации в завивимости от размера и концентрации частиц. Установлено, что наночастицы П-ОГ модулируют метаболизм клеток гибридомы BAP3 в высокой концентрации (25 мкг/мл), при этом размерность частиц не имела принципиального значения. Так, П-ОГм и П-ОГб (25 мкг/мл) стимулировали дыхательную активность клеток, снижали резервную дыхательную способность митихондрий, а также подавляли гликолитическую активность этих клеток. В отношении моноцитов установлено, что наночастицы ОГ в концентрации 25 мкг/мл способны модулировать метаболизм моноцитов, стимулируя их дыхательную активность, снижая дыхательную способность митохондрий и их гликолитическую активность. Также было показано, что наночастицы ОГ поглощаются моноцитами, но при этом сохраняя их жизнеспособность. На данный момент мы не можем сделать выводы о влиянии наночастиц ОГ на метаболизм дендритных клеток (ДК), поскольку больщой разброс значений и не воспроизводимость данных не позволяют сделать выводы о том, как наночастиц ОГ модулируют метаболизм ДК. Установлено, что что клетки THP-1 (моноцитарная линия) способны активно поглощать наночастицы ОГ, процессы зависели от концентрации и типа частиц. В то же время, жизнеспособность клеток не изменялась в присутствии наночастиц. Что касается метаболизма, то наночастицы ОГ-ПЭГм (25 мкг/мл) увеличивали базальное дыхание клеток, но снижают максимальную OCR, митохондриальную резервную емкость и скорость гликолиза. В отношении нейтрофилов установлено, что наночастицы ОГ способны регулировать продукции АФК этими клетками, при этом наночастицы ОГ в концентрации 25 мкг/мл способны модулировать метаболизм нейтрофилов, снижая дыхательную способность митохондрий, но стимулируя их гликолитическую активность. В целом, мы продемонстрировали, что наночастицы ОГ способны модулировать метболизм таргетных субпопуляций клеток, при этом достоверные эффекты оказывала большая концентрация наночастиц (25 мкг/мл), при этом низкие концентраций не оказывали значимых эффектов. Важно, что размерность частиц, а также тип ПЭГ не имел принципиального значения. Полученные данные позволяют предположить, что при администрации in vivo наночастицы ОГ-ПЭГ в низких концентрациях также не окажут существенного влияния на Т-клеточное звено иммунитета, а также на активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью проекта является изучение биосовместимости наночастиц ОГ с клетками иммунной системы. Для реализации проекта использовали наночастицы ОГ с латеральными размерами 100-200 нм (ОГм) и 1-5 мкм (ОГб) были функционализированные ПЭГ (П-ОГ), полимером, способным улучшать коллоидную стабильность и профиль токсичности наноматериалов. В рамках 2023 года было проведено экспериментальное исследование возможностей графен-индуцированной гипертермии в системе in vitro. В качестве объектов использовали клеточные линии THP-1 и Jurkat 5332 и суспензию мононуклеарных клеток человека. Для изучения графен-индуцированной гипертермии использовали лампу для фототерапии Hydrosun 750 (Hydrosun Medizintechnik, Германия) (мощность 225 мВт/см² ±10%). При изучении подъема температуры в присутствии нанчоастиц ОГ были получены ожидаемые результаты по линейному повышению температуры под воздействием ИК-облучения. Эксперименты были проведены в два этапа – после предварительной получасовой инкубации клеток в наночастицами был проведен ИК-нагрев в течении 2 часов, после его оценивали жизнеспособность, апоптоз, а также в ряде случаев цитокиновый профиль по истечении 25 минут и 24 часов для изучения отсроченного эффекта. По итогам серии экспериментов установлено, что графен-индуцированная гипертермия не оказывает влияния на жизнеспособность и показатели раннего апотоза клеток линий THP-1 и Jurkat как непосредственно после облучения, так и спустя 24 часа. Однако, установлено, что число клеток линии Jurkat в состоянии позднего апоптоза повышается спустя 24 часа после 25-минутного облучения в присутствии крупных частиц ОГ (1-5 мкм) в высокой концентрации (25 мкг/мл) вне зависимости от типа поверхностной функционализации. Таким образом, проведённые эксперименты показали, что клеточная линия Jurkat в большей степени подвержена эффектам графен-индуцированнной гипертермии, нежели клетки линии THP-1. При этом все зафиксированные изменения наблюдались спустя сутки после инкубации, что свидетельствует об отложенном эффекте гипертермии. Кроме того, клеточные линии оказались устойчивы к гипертермическому воздействию, так как даже при значительном повышении температуры среды при облучении (до 38,95 – 42,55°C при 25-минутном облучении) клетки сохраняют высокую жизнеспособность. Важно отметить, что при аналогичных условиях нормальные клетки иммунной системы (МНК) не были подвержены графен-индуцированной гипертермии. Так, нагрев клеток не оказывал достоверного влияния на их жизнеспособность и показатели апоптоза. При изучении влияния наночастиц ОГ на цитокиновый профиль изучаемых клеток (THP-1 и Jurkat) после 24 ч культивирования установлено, что клетки линии Jurkat не продуцировали валидные уровни цитокинов. В отношении клеточной линии THP-1 установлено, что наночастицы ОГ вызывали продукцию MIP-1b, TNF-a, IL-8, при этом не влияли на продукцию G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17A, MCP-1 (MCAF). Достоверный эффект оказывали только наночастицы бОГп в концентрации 25 мкг/мл. В то же время, в условиях ИК-облучения, мы не обнаружили достоверных эффектов для используемых наночастиц ОГ, при этом сохранялась общая тенденция к повышению уровня MIP-1b под воздействием наночастиц большого размер, покрытых разветвленным ПЭГ в концентрации 25 мкг/мл. Таким образом, при изучении цитокинового профиля патологически измененных клеточный линий под воздействием наночастиц ОГ установлено, что на уровне Jurkat эффектов не обнаружено. В отношении клеточной линии THP-1 установлено, что наночастицы ОГ вызывали фоновую продукцию MIP-1b, TNF-a, IL-8, при этом воздействие на культуры клеток THP-1 ИК-излучением не влияло на продукцию цитокинов. В целом, мы установили, что клеточная линия Jurkat в большей степени подвержена эффектам графен-индуцированнной гипертермии, нежели клетки линии THP-1. При этом все зафиксированные изменения наблюдались спустя сутки после инкубации, что свидетельствует об отложенном эффекте гипертермии. Также важно отметить, что для нормальных клеток иммунной системы (МНК) графен-индуцируемая гипертермия в предлагаемых условиях не вызывает снижения жизнеспособности клеток. По-видимому, дальнейшая перспектива разработки темы заключается в создании и исследовании наночастиц ОК с пришитыми лигандами против конкретного маркера на поверхности патологически-измененных лимфоидных клеток.