Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В основу настоящего проекта легли полученные нами ранее данные об участии опухолевых экзосом в распространении гормональной резистентности горизонтальным путем, от резистентных к чувствительным клеткам. На предыдущих этапах выполнения проекта было продемонстрировано развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы MCF-7 при культивировании с экзосомами, полученными от тамоксифен-резистентной сублинии клеток; идентифицированы некоторые из микроРНК, в том числе микроРНК-181а, гиперэкспрессированные в экзосомах резистентных клеток и участвующие в формировании резистентного фенотипа клеток; впервые описан феномен подавления экспрессии DNMT3a в резистентных клетках. Целью настоящего этапа проекта явилось дальнейшее изучение механизма экзосом-индуцированной гормональной резистентности, в том числе исследование значения подавления экспрессии DNMT3a в развитии гормональной резистентности и роли экзосомальных микроРНК в регуляции экспрессии DNMT3a и метилирования ДНК. Анализ уровня метилирования LINE повторов методом бисульфитного секвенирования показал достоверное снижение метилирование в резистентных клетках по сравнению с родительскими клетками. Аналогичная тенденция - снижение метилирования в резистентных клетках - обнаружена при изучении метилирования предшественников микроРНК-181а: «host gene» NR6A1, принадлежащего семейству орфановых рецепторов, и длинной некодирующей микроРНК lnc-pri-miRNA. Напротив, нокдаун DNMT3а при трансфеции в клетки siRNA DNMT3а приводит к деметилированию LINE повторов, деметилированию ДНК предшественника микроРНК-181а - «host gene» NR6A1 и увеличению экспрессии длинной некодирующей РНК lnc-pri-miRNA-181. Нокдаун DNMT3а сопровождается развитием частичной гормональной резистентности клеток, что подтверждает важную роль снижения экспрессии DNMT3a и деметилирования ДНК в формировании приобретенной гормональной резистентности. Мы показали, что развитие резистентности к таргетным препаратам, в частности - ингибитору mTOR рапамицину, сопровождается сходными изменениями метилирования ДНК, обнаруженными в клетках, резистентных к тамоксифену: подавлением экспрессии DNMT3a, снижением метилирования LINE повторов, а также деметилированием предшественников микроРНК-181а: «host gene» NR6A1 и длинной некодирующей РНК lnc-pri-miRNA-181. Исследование внутриклеточного сигналинга показало, что в обоих вариантах резистентных клеток отмечается выраженная активация протеинкиназы Akt - ключевого белка, участвующего в передаче ростового и антиапоптотического сигналов. Продемонстрировано, что микроРНК-181а при трансфекции в клетки приводит к подавлению DNMT3a и увеличению экспрессии и активности протеинкиназы Akt, что свидетельствует об участии сигнального пути микроРНК-181а/DNMT3а в активации Akt. При исследовании профиля микроРНК в родительских и резистентных клетках идентифицированы микроРНК-супрессоры протеинкиназы Akt, в том числе микроРНК-484, содержание которой резко снижено в резистентных сублиниях. В экспериментах по трансфекции в клетки MCF-7 микроРНК-484 обнаружено выраженное подавление экспрессии и активности Akt под действием микроРНК-484, которое сопровождается повышением чувствительности клеток к цитостатическому действию тамоксифена и рапамицина. В целом, полученные данные свидетельствуют о важной роли деметилирования ДНК в развитии резистентности опухолевых клеток к таргетным и гормональным препаратам, и позволяют идентифицировать отдельные микроРНК, ассоциированные с резистентным фенотипом и участвующие в регуляции ключевых ферментов метилирования ДНК и экспрессии ключевых белков внутриклеточного сигналинга.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На предыдущих этапах выполнения проекта было продемонстрировано развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы MCF-7 при культивировании с экзосомами, полученными от резистентных сублиний клеток; идентифицированы некоторые из микроРНК, в том числе микроРНК-181а, гиперэкспрессированные в экзосомах резистентных клеток и участвующие в формировании резистентного фенотипа клеток. Целью настоящего этапа проекта явилось дальнейшее изучение влияния микроРНК-181а на клеточный сигналинг и идентификация основных мишеней микроРНК-181а, асоциированных с формированием резистентного фенотипа опухолевых клеток. Ранее мы показали, что многократная трансфекция в клетки MCF-7 микроРНК-181а приводит к развитию частичной гормональной резистентности на фоне подавления экспрессии ДНК метилтрансферазы 3а (DNMT3a) и активизации одного из основных антиапоптотических белков - протеинкиназы Akt. В настоящих экспериментах был проведен анализ действия микроРНК-181а на расширенной панели сигнальных белков (анти)апоптотического и ростового каскадов, в результате которого было выявлено существенное увеличение экспрессии Snail1 - одного из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода - на фоне практической неизмененной экспрессии Slug и белков mTOR и МАР киназного каскадов. Трансфекция плазмиды, кодирующей дикий вариант wtSnail1, вызывает развитие частичной резистентности клеток MCF-7 к тамоксифену и рапамицину, которое сопровождается, как и в случае с трансфекцией микроРНК-181а, стимуляцией протеинкиназы Akt и снижением экспрессии DNMT3a. В целом, полученные результаты позволяют рассматривать DNMT3a в качестве одного из эффекторов микроРНК-181а2/ Snail сигналинга. Обнаружено, что резистентные сублинии MCF-7/T и MCF-7/Rap, полученные в результате селекции клеток MCF-7 в присутствии тамоксифена и рапамицина, соответственно, отличаются низким уровнем экспрессии DNMT3a. В экспериментах по трансфекции siDNMT3a в клетки MCF-7 мы показали, что нокдаун DNMT3а приводит к снижению чувствительности клеток к рост-ингибирующему действию тамоксифена и рапамицина. Для подтверждения роли DNMT3a в формировании резистентного фенотипа клеток были проведены эксперименты на независимой культуре эстрогеннезависимого рака молочной железы MDA-MB-231. Определение экспрессии DNMT3a показало резкое снижение содержания белка и мРНК DNMT3a в клетках MDA-MB-231, сопоставимое с таковым в клетках резистентных сублиний MCF-7/T и MCF-7/Rap. Как и в случае с резистентными сублиниями MCF-7/T и MCF-7/Rap, снижение экспрессии DNMT3a в клетках MDA-MB-231 коррелировало со снижением метилирования LINE повторов - основного маркера, используемого для оценки статуса метилирования ДНК в исследуемых образцах. В целом, полученные данные свидетельствуют, что подавление DNMT3a является одним из факторов, определяющих формирование резистентного фенотипа опухолевых клеток. Исследование содержания NR6A1 - одного из факторов, контролирующих активность ДНК-метилтрансфераз, выявило резкое снижение экспрессии NR6A1 в резистентных сублиниях MCF-7. Более того, аналогичное снижение экспрессии NR6A1 было выявлено и в независимых резистентных клетках - MDA-MB-231. Обнаружено, что пониженная экспрессия гена NR6A1 в резистентных клетках ассоциирована с изменением статуса метилирования кодирующих последовательностей гена NR6A1. Нокдаун NR6A1 в родительских клетках MCF-7 приводит к снижению экспрессии DNMT3A и частичной потере чувствительности клеток к тамоксифену и рапамицину, что свидетельствует о координированной регуляции NR6A1 и DNMT3A при формировании резистентного фенотипа рака молочной железы. Анализ протеинкиназы Akt в клетках после нокдауна NR6A1 и DNMT3A выявил резкое усиление фосфорилирования Akt, что позволяет рассматривать Akt как один из ключевых эффекторов NR6A1/ DNMT3A, участвующих в развитии приобретенной резистентности опухолевых клеток. В результате скрининга потенциальных ингибиторов Akt был отобран luminespib как препарат, проявляющий максимальную цитостатическую активность, и продемонстрирована возможность его применения для подавления роста резистентных клеток. Таким образом, основным итогом заключительного этапа проекта явилось установление основных эффекторов микроРНК-181а2 - белков сигнального каскада Snail1/ NR6A1/ DNMT3A/ протеинкиназа Akt, определяющих формирование резистентного фенотипа клеток рака молочной железы. Впервые описан феномен подавления транскрипционного рецептора NR6A1 при развитии резистентности клеток рака молочной железы к гормональным и таргетным препаратам, что позволяет рассматривать NR6A1 в качестве потенциального маркера чувствительности опухолей к соответствующей терапии.