КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-15-00245

НазваниеРоль экзосомальных микроРНК в формировании приобретенной гормональной резистентности злокачественных опухолей

РуководительКрасильников Михаил Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н.Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2022 г. - 2023 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (35).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология

Ключевые словаонкология, микроРНК, гормональная резистентность, рак молочной железы

Код ГРНТИ76.29.49


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Рак молочной железы - главным образом гормонозависимое заболевание, при котором рецепторы эстрогенов экспрессируются в более чем 70 % случаев и являются важной терапевтической мишенью. Эффективность гормонотерапии, направленной либо на инактивацию рецептора эстрогенов, либо на снижение пула эндогенных эстрогенов, ограничена развитием резистентности - врожденной или сформированной на фоне приема антигормональных препаратов. Если врожденная резистентность, как правило, связана с мутациями определенных генов, инактивирующих гормональный сигналинг (в первую очередь - репрессия рецепторов гормонов) и/или стимулирующих гормоннезависимый ростовой сигнал (активация тирозинкиназного каскада и проч.), то в развитии приобретенной резистентности геномные мутации играют существенно меньшую роль, и на первый план здесь выходят эпигеномные факторы. Среди последних отдельное значение имеют микроРНК, выступающие как в роли самостоятельных эпигеномных факторов, ограничивающих экспрессию определенных генов, так и опосредованно - через регуляцию метилирования и ацетилирования ДНК. В последние годы все большее внимание в изучении механизма формирования резистентного фенотипа клеток уделяется экззосомам - микровезикулам, продуцируемых клетками в окружающую среду и способных инкорпорироваться в клетки-реципиенты. В выполненных ранее нами экспериментах на клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 и тамоксифен-резистентной сублинии MCF-7/T мы продемонстрировали способность экзосом, продуцируемых резистентными клетками, индуцировать развитие гормональной резистентности в клетках родительской линии. Основной целью настоящего проекта является исследование механизма межклеточной передачи гормональной резистентности с участием микроРНК, продуцируемых резистентными клетками в составе экзосом. В рамках проекта 2019 был проведен анализ микроРНК, содержащихся в экзосомах резистентных клеток, идентифицированы отдельные микроРНК, гиперэкспрессированные в экзосомах резистентных клеток и продемонстрирована способность некоторых из них индуцировать развитие гормональной резистентности в эстрогензависимых родительских клетках. Мы показали, что одна из идентифицированных подобным образом микроРНК - микроРНК-181, обладает двойной активностью: наряду с известной способностью подавлять эстрогеновый сигналинг является еще эффективным супрессором ДНК-метилтрансферазы 3а (DNMT3a). Дальнейший анализ экспрессии последней в резистентных клетках, как в клетках, полученных после длительного культивирования с тамоксифеном (MCF-7/T), так и в клетках, полученных после культивирования с экзосомами от резистентных клеток (MCF-7/exoT) или клетках после многократной трансфекции микроРНК-181 (MCF-7/mir-181) выявил существенное снижение содержания DNMT3a, что свидетельствует о возможном участии последней в регуляции гормонального ответа. Параллельный анализ содержания микроРНК-181 показал стабильно высокое ее содержание во всех вариантах резистентных клеток, в том числе спустя длительное время после трансфекции или обработками экзосомами, доказывающих существование в резистентных клетках механизма самоподдержания высокого уровня микроРНК-181. Новые задачи проекта 2022 включают изучение двух фундаментальных механизмов в действии экзосомальных микроРНК: во-первых, исследование механизма самоподдержания высокого уровня микроРНК в клетках-реципиентах (как мы обнаружили, клетки после многократной трансфекции микроРНК-181 поддерживают ее высокий уровень длительное время после трансфекции), в том числе участия в этом процессе DNMT3a; и, во-вторых, исследование механизма активации эстрогеннезависимых сигнальных путей под действием микроРНК (в частности, активацию Akt-сигналинга и некоторых других путей в трансфецированных или обработанных резистентными экзосомами клетках).

Ожидаемые результаты
Эксперименты будут проводиться на культивируемых in vitro клетках эстрогензависимого рака молочной железы линии MCF-7 и трех независимых резистентных сублиниях: MCF-7/T, MCF-7/exoT и MCF-7/mir-181. По итогам выполнения проекта планируется: - установить механизм, ответственный за поддержание высокого уровня микроРНК-181 в резистентных клетках, в том числе: исследовать возможность деметилирования промоторов ДНК, кодирующей микроРНК-181, и изучить связь деметилирования микроРНК-181с подавлением DNMT3a; - идентифицировать основные транскрипционные факторы, участвующие в регуляции экспрессии микроРНК-181, и исследовать их роль в поддержании высокого уровня микроРНК-181 в резистентных клетках; - установить роль микроРНК-181 в активации эстроген-независимого ростового сигналинга, в том числе: получить данные о влиянии микроРНК-181 на PTEN/PI3K/Akt сигнальный путь и митоген-ассоциированные транскрипционные факторы (AP-1, NF-kB, Snail, LEF-1/b-catenin); исследовать возможность полиморфизма последовательностей ДНК, кодирующих микроРНК-181; получить данные о влиянии комбинированого воздействия активаторов микроРНК-181 и ингибиторов DNMT3a на гормональную чувствительность клеток рака молочной железы. В целом, мы рассчитываем, что по итогам выполнения проекта будет установлен механизм распространения гормональной резистентности по пулу опухолевых клеток с участием экзосомальных микроРНК и разработаны экспериментальные подходы к ослаблению такой резистентности при направленном воздействии на сигнальные пути, контролируемые идентифицированными экзосомальными микроРНК.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В основу настоящего проекта легли полученные нами ранее данные об участии опухолевых экзосом в распространении гормональной резистентности горизонтальным путем, от резистентных к чувствительным клеткам. На предыдущих этапах выполнения проекта было продемонстрировано развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы MCF-7 при культивировании с экзосомами, полученными от тамоксифен-резистентной сублинии клеток; идентифицированы некоторые из микроРНК, в том числе микроРНК-181а, гиперэкспрессированные в экзосомах резистентных клеток и участвующие в формировании резистентного фенотипа клеток; впервые описан феномен подавления экспрессии DNMT3a в резистентных клетках. Целью настоящего этапа проекта явилось дальнейшее изучение механизма экзосом-индуцированной гормональной резистентности, в том числе исследование значения подавления экспрессии DNMT3a в развитии гормональной резистентности и роли экзосомальных микроРНК в регуляции экспрессии DNMT3a и метилирования ДНК. Анализ уровня метилирования LINE повторов методом бисульфитного секвенирования показал достоверное снижение метилирование в резистентных клетках по сравнению с родительскими клетками. Аналогичная тенденция - снижение метилирования в резистентных клетках - обнаружена при изучении метилирования предшественников микроРНК-181а: «host gene» NR6A1, принадлежащего семейству орфановых рецепторов, и длинной некодирующей микроРНК lnc-pri-miRNA. Напротив, нокдаун DNMT3а при трансфеции в клетки siRNA DNMT3а приводит к деметилированию LINE повторов, деметилированию ДНК предшественника микроРНК-181а - «host gene» NR6A1 и увеличению экспрессии длинной некодирующей РНК lnc-pri-miRNA-181. Нокдаун DNMT3а сопровождается развитием частичной гормональной резистентности клеток, что подтверждает важную роль снижения экспрессии DNMT3a и деметилирования ДНК в формировании приобретенной гормональной резистентности. Мы показали, что развитие резистентности к таргетным препаратам, в частности - ингибитору mTOR рапамицину, сопровождается сходными изменениями метилирования ДНК, обнаруженными в клетках, резистентных к тамоксифену: подавлением экспрессии DNMT3a, снижением метилирования LINE повторов, а также деметилированием предшественников микроРНК-181а: «host gene» NR6A1 и длинной некодирующей РНК lnc-pri-miRNA-181. Исследование внутриклеточного сигналинга показало, что в обоих вариантах резистентных клеток отмечается выраженная активация протеинкиназы Akt - ключевого белка, участвующего в передаче ростового и антиапоптотического сигналов. Продемонстрировано, что микроРНК-181а при трансфекции в клетки приводит к подавлению DNMT3a и увеличению экспрессии и активности протеинкиназы Akt, что свидетельствует об участии сигнального пути микроРНК-181а/DNMT3а в активации Akt. При исследовании профиля микроРНК в родительских и резистентных клетках идентифицированы микроРНК-супрессоры протеинкиназы Akt, в том числе микроРНК-484, содержание которой резко снижено в резистентных сублиниях. В экспериментах по трансфекции в клетки MCF-7 микроРНК-484 обнаружено выраженное подавление экспрессии и активности Akt под действием микроРНК-484, которое сопровождается повышением чувствительности клеток к цитостатическому действию тамоксифена и рапамицина. В целом, полученные данные свидетельствуют о важной роли деметилирования ДНК в развитии резистентности опухолевых клеток к таргетным и гормональным препаратам, и позволяют идентифицировать отдельные микроРНК, ассоциированные с резистентным фенотипом и участвующие в регуляции ключевых ферментов метилирования ДНК и экспрессии ключевых белков внутриклеточного сигналинга.

 

Публикации

1. Андреева О.Е., Сорокин Д.В., Щербаков А.М., Гудкова М.В., Красильников М.А. Сигнальный путь микроРНК-484/Akt в регуляции чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым препаратам Успехи молекулярной онкологии, Успехи молекулярной онкологии 2022; 9(4) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17650/2313-805X-2022-9-4-112-116

2. Воробьева Н.А., Паулович Д.И., Сальникова Д.И., Сорокин Д.В., Щербаков А.М., Пивень Ю.А. 4,5,6,7-Tetrahydrobenzo[D]Isoxazol-4-Ylamides As Novel Hsp90 Inhibitors: Design, Synthesis, and Biological Evaluation Тезисы докладов XIX Международной научной конференции молодых ученых, Тезисы докладов XIX Международной научной конференции молодых ученых, с.550-551, Минск, 25-28 октября 2022 г., стендовый доклад. (год публикации - 2022)

3. Воробьева Н.А., Сальникова Д.И., Паулович Д.И., Богданов Ф.Б., Михайлова А.Л., Сорокин Д.В., Щербаков А.М., Лахвич Ф.А., Пивень Ю.А. Design, synthesis, and biological evaluation of 4-acylamino-tetrahydrobezisoxazoles as novel Hsp90 inhibitors Материалы конференции «Белорусские лекарства», Международная научно-практическая конференция «Белорусские лекарства». 23-25 ноября 2022 г., Минск, Национальная академия наук Беларуси, Материалы конференции, с.42-43. (год публикации - 2022)

4. Щеголев Ю.Ю., Андреева О.Е., Сорокин Д.В., Щербаков А.М., Красильников М.А. Механизм экзосоминдуцированной передачи резистентности к ингибиторам mTOR в клетках рака молочной железы Успехи молекулярной онкологии, Материалы VII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии. Успехи молекулярной онкологии, 2022, Т.9, № 4. П.1, С.26-27 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.17650/2313-805X-2022-9-4-112-116


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На предыдущих этапах выполнения проекта было продемонстрировано развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы MCF-7 при культивировании с экзосомами, полученными от резистентных сублиний клеток; идентифицированы некоторые из микроРНК, в том числе микроРНК-181а, гиперэкспрессированные в экзосомах резистентных клеток и участвующие в формировании резистентного фенотипа клеток. Целью настоящего этапа проекта явилось дальнейшее изучение влияния микроРНК-181а на клеточный сигналинг и идентификация основных мишеней микроРНК-181а, асоциированных с формированием резистентного фенотипа опухолевых клеток. Ранее мы показали, что многократная трансфекция в клетки MCF-7 микроРНК-181а приводит к развитию частичной гормональной резистентности на фоне подавления экспрессии ДНК метилтрансферазы 3а (DNMT3a) и активизации одного из основных антиапоптотических белков - протеинкиназы Akt. В настоящих экспериментах был проведен анализ действия микроРНК-181а на расширенной панели сигнальных белков (анти)апоптотического и ростового каскадов, в результате которого было выявлено существенное увеличение экспрессии Snail1 - одного из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода - на фоне практической неизмененной экспрессии Slug и белков mTOR и МАР киназного каскадов. Трансфекция плазмиды, кодирующей дикий вариант wtSnail1, вызывает развитие частичной резистентности клеток MCF-7 к тамоксифену и рапамицину, которое сопровождается, как и в случае с трансфекцией микроРНК-181а, стимуляцией протеинкиназы Akt и снижением экспрессии DNMT3a. В целом, полученные результаты позволяют рассматривать DNMT3a в качестве одного из эффекторов микроРНК-181а2/ Snail сигналинга. Обнаружено, что резистентные сублинии MCF-7/T и MCF-7/Rap, полученные в результате селекции клеток MCF-7 в присутствии тамоксифена и рапамицина, соответственно, отличаются низким уровнем экспрессии DNMT3a. В экспериментах по трансфекции siDNMT3a в клетки MCF-7 мы показали, что нокдаун DNMT3а приводит к снижению чувствительности клеток к рост-ингибирующему действию тамоксифена и рапамицина. Для подтверждения роли DNMT3a в формировании резистентного фенотипа клеток были проведены эксперименты на независимой культуре эстрогеннезависимого рака молочной железы MDA-MB-231. Определение экспрессии DNMT3a показало резкое снижение содержания белка и мРНК DNMT3a в клетках MDA-MB-231, сопоставимое с таковым в клетках резистентных сублиний MCF-7/T и MCF-7/Rap. Как и в случае с резистентными сублиниями MCF-7/T и MCF-7/Rap, снижение экспрессии DNMT3a в клетках MDA-MB-231 коррелировало со снижением метилирования LINE повторов - основного маркера, используемого для оценки статуса метилирования ДНК в исследуемых образцах. В целом, полученные данные свидетельствуют, что подавление DNMT3a является одним из факторов, определяющих формирование резистентного фенотипа опухолевых клеток. Исследование содержания NR6A1 - одного из факторов, контролирующих активность ДНК-метилтрансфераз, выявило резкое снижение экспрессии NR6A1 в резистентных сублиниях MCF-7. Более того, аналогичное снижение экспрессии NR6A1 было выявлено и в независимых резистентных клетках - MDA-MB-231. Обнаружено, что пониженная экспрессия гена NR6A1 в резистентных клетках ассоциирована с изменением статуса метилирования кодирующих последовательностей гена NR6A1. Нокдаун NR6A1 в родительских клетках MCF-7 приводит к снижению экспрессии DNMT3A и частичной потере чувствительности клеток к тамоксифену и рапамицину, что свидетельствует о координированной регуляции NR6A1 и DNMT3A при формировании резистентного фенотипа рака молочной железы. Анализ протеинкиназы Akt в клетках после нокдауна NR6A1 и DNMT3A выявил резкое усиление фосфорилирования Akt, что позволяет рассматривать Akt как один из ключевых эффекторов NR6A1/ DNMT3A, участвующих в развитии приобретенной резистентности опухолевых клеток. В результате скрининга потенциальных ингибиторов Akt был отобран luminespib как препарат, проявляющий максимальную цитостатическую активность, и продемонстрирована возможность его применения для подавления роста резистентных клеток. Таким образом, основным итогом заключительного этапа проекта явилось установление основных эффекторов микроРНК-181а2 - белков сигнального каскада Snail1/ NR6A1/ DNMT3A/ протеинкиназа Akt, определяющих формирование резистентного фенотипа клеток рака молочной железы. Впервые описан феномен подавления транскрипционного рецептора NR6A1 при развитии резистентности клеток рака молочной железы к гормональным и таргетным препаратам, что позволяет рассматривать NR6A1 в качестве потенциального маркера чувствительности опухолей к соответствующей терапии.

 

Публикации

1. Андреева О.Е., Сорокин Д.В., Винокурова С.В., Щеголев Ю.Ю., Елкина Н.В., Катаргин А.Н., Фасхутдинов Р.С., Сальникова Д.И., Щербаков А.М., Красильников М.А. The effect of DNA methyltransferase 3A suppression in progression of the resistance phenotype in breast cancer cells Advances in Molecular Oncology (Uspehi Molekularnoj Onkologii), 2023;10(4) (год публикации - 2023)

2. Андреева О.Е., Щеголев Ю.Ю., Щербаков А.М., Сорокин Д.В., Винокурова С.В., Катаргин А.Н., Сальникова Д.И., Красильников М.А. The Phenomenon of the Cross-Resistance of Breast Cancer to Target and Hormonal Drugs: The Role of Epigenetic Reconstruction Medical Sciences Forum, 2023; 20(1):5. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/IECC2023-14220

3. Сорокин Д.В., Крымов С.К., Чередниченко М.Н., Михайлова А.Л., Сальникова Д.И., Щекотихин А.Е., Щербаков А.М. Inhibitory Effects of 5-Fluorouracil on the Growth of 4-Hydroxytamoxifen-resistant and Sensitive Breast Cancer Cells Engineering Proceedings, 2023, ASEC2023-16332 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ASEC2023-16332

4. Щеголев Ю.Ю., Сорокин Д.В., Щербаков А.М., Андреева О.Е., Сальникова Д.И., Михаевич Е.И., Гудкова М.В., Красильников М.А. Exosomes are involved in the intercellular transfer of rapamycin resistance in the breast cancer cells BioImpacts, 2023, 13(4), 313–321 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.34172/bi.2023.27490

5. Щербаков А.М., Башарина А.А., Сорокин Д.В., Михаевич Е.И., Михайлова А.Л., Богуш Т.А., Красильников М.А. Glucose Starvation Promotes anti-PD-L1 and anti-GLUT1 Activity of Metformin on Skin Cancer Cells Letters in Applied NanoBioScience, - (год публикации - 2024)

6. Щербаков А.М., Богданов Ф.Б., Михайлова А.Л., Андреева О.Е., Сальникова Д.И. Targeting AKT Kinase in Hydroxytamoxifen-Resistant Breast Cancer Cells Medical Sciences Forum, 2023; 20(1):4 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/IECC2023-14224

7. Щербаков А.М., Воронцова С.К., Хамидуллина А.И., Мрджанович Я., Андреева О.Е., Богданов Ф.Б., Сальникова Д.И., Юришич В., Заварзин И.В., Ширинян В.З. Novel pentacyclic derivatives and benzylidenes of the progesterone series cause anti-estrogenic and antiproliferative effects and induce apoptosis in breast cancer cells Invest New Drugs, 2023 Feb;41(1):142-152 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s10637-023-01332-z


Возможность практического использования результатов
Результаты проекта будут востребованы при формировании будущих стратегий персонализированного лечения больных с резистентными новообразованими. Полученные сведения возможно использовать при создании систем для профилирования опухолей.