Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения работ проекта в 2022 году согласно плану работ были проведены эксперименты по выяснению роли метилированных порфиринов в структурной и функциональной модификации мембран микобактерий. Для этого была исследована динамика изменения микровязкости мембран, содержания метилированных порфиринов, жирнокислотного состава мембран, активности дыхательной цепи в процессе перехода микобактерий в состояние покоя и при реактивации, и проведена корреляция этих параметров. Для усиления продукции эндогенных порфиринов к микобактериям была добавлена 5-аминолевулиновая кислота (АЛК). Анализ микровязкости продемонстрировал явное увеличение анизотропии флуоресценции (а значит и микровязкости мембран) в клетках, выращенных в присутствии АЛК и содержащих в 2 раза больше эндогенных порфиринов. Таким образом, мы продемонстрировали, что увеличение концентрации порфиринов в мембранах микобактерий, переходящих в состояние покоя, коррелирует с более быстрым увеличением микровязкости мембран этих клеток по сравнению с контрольными, порфирины в которых накапливаются более медленно. Снижение активности дыхания и активности ДФИ - редуктазы в клетках M. smegmatis, выращенных с АЛК, по сравнению с контрольными клетками аналогичного физиологического состояния, указывает на возможную структурную модификацию мембраны молекулами порфирина. Было выявлено, что при неизменном количестве микобактериальных клеток, состава жирных кислот, активности дыхания, уровня транскрипции в течение 16 часов реактивации покоящихся форм M. smegmatis микровязкость мембран уменьшается через 8 ч от начала процедуры реактивации. В этот же период (8-12 ч) наблюдалось заметное снижение концентрации тетраметилового эфира копропорфирина в клетках. Таким образом, накопление тетраметилового эфира копропорфирина в мембранах микобактерий приводит к увеличению микровязкости мембран и ингибированию ферментов дыхательной цепи, и, наоборот. Можно предположить, что этерифицированные гидрофобные формы порфиринов встраиваются в зоны расположения миколовых кислот в клеточной оболочке, усиливая плотность и прочность их упаковки, стабилизируют и консервируют компоненты мембран, подготавливая их к переживанию неблагоприятных условий. При реактивации происходит довольно быстрое деметилирование мембранного порфирина с образованием копропорфирина, который может быстро утилизироваться в синтезе гема и гем-содержащих белков, например цитохромов. Второй задачей в отчетном периоде являлось изучение роли метилтрансферазы MSMEG_0614/Rv0281 в образование метиловых эфиров копропорфиринов и структурных изменениях мембран при переходе микобактерий в состояние покоя. Для этого были получены штаммы микобактерий с гиперэкспрессией этих метилтрансфераз и проведена их характеристика. Установлено, что при гиперэкспрессии метилтрансферазы MSMEG_0614 в клетках микобактерий происходит более интенсивное накопление тетраметилового эфира копропорфирина как при переходе микобактерий в состояние покоя, так и при росте в оптимальных условиях по сравнению с контрольным штаммом. Штаммы микобактерий с гиперэкспрессией метилтрансферазы и с увеличенным содержанием тетраметилового эфира копропорфирина демонстрировали повышенную микровязкость мембран в отличие от контрольного штамма. Было оценено влияние антибиотиков на продукцию порфиринов в клетках M. tuberculosis. В присутствии рифампицина наблюдается значительно подавление синтеза и накопления порфиринов в клетках возбудителя туберкулеза. Однако в присутствии изониазида, а также его метаболита – гидразина, наблюдается увеличение концентрации порфиринов в 1,8 раза. Были проведены эксперименты по выяснению природы метаболита с пиком флуоресценции 660 нм, наблюдаемом при конфокальной микроскопии клеток M. tuberculosis при возбуждении 400 нм. Были подобраны условия выращивания культуры для получения ярко выраженного сигнала флуоресценции на 650-660 нм и исследованы экстракты клеток из этих культур. Было выяснено, что причиной появления дополнительных длинноволновых пиков в спектре флуоресценции клеток M. tuberculosis при возбуждении 400 нм являются фотохимические реакции накопленного в ходе биосинтеза копропорфирина. Освещение, которому подвергались клетки в процессе работы на конфокальном микроскопе, приводили к образованию фотопродуктов, токсичность которых для микобактерий необходимо будет установить. Установлено, что вегетативные клетки M. tuberculosis могут продуцировать и накапливать порфирины в течение 10 дней со-культивирования с макрофагами легких в присутствии АЛК, что приводит к развитию их фоточувствительности. Синергичное действие порфиринов, накопленных в макрофагах и в микобактериях при культивировании в присутствии АЛК приводило к полной инактивации как вегетативных, так и покоящихся клеток M. tuberculosis, персистирующих в макрофагах. Если макрофаги не содержали порфиринов, то фоточувствительность микобактерий оставалась довольно значительной (99,99%), но не наблюдалось полной стерилизации культуры.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2023 году согласно плану работ были проведены эксперименты по выяснению роли метилтрансферазы MSMEG_0614 в образовании тетраметилового эфира копропорфирина (ТМК) при переходе Mycobacterium smegmatis в состояние покоя и увеличении микровязкости мембран покоящихся микобактерий. Для этого был получен мутантный штамм M. smegmatis с делецией гена MSMEG_0614 и исследован уровень ТМК, микровязкость мембран и устойчивость к стрессовым воздействиям покоящихся форм полученного штамма. В результате делеции метилтрансферазы MSMEG_0614 в мембранах покоящихся форм M. smegmatis наблюдается значительное снижение количества тетраметилового эфира копропорфирина, что, в свою очередь, вероятно, приводит к снижению вязкости мембран таких бактерий и увеличению их чувствительности к стрессовым воздействиям. Второй задачей проекта являлось исследование факторов, влияющих на активность микобактериальных ферментов, участвующих в синтезе и метаболизме порфиринов. Было установлено, что активность исследуемых ферментов (АЛК-синтаза и метилтрансфераза копропорфирина) прежде всего зависела от присутствия ионов магния в реакционной смеси. Кроме этого, на АЛК-синтазу активирующее действие оказывал цинк. Магний и цинк не влияли на активность копрогем декарбоксилазы, в отличие от перекиси водорода. Для активности копрогем декарбоксилазы необходимы анаэробные условия и наличие перекиси водорода. Для всех этих ферментов наличие НАДН и НАДФ не влияло на активность. В присутствии ЭДТА наблюдалось полное ингибирование АЛК-синтазы и копрогем декарбоксилазы. D-глюкоза ингибировала активность АЛК-синтазы. Проведена фотоинактивация микобактерий с использованием светодиода, соответствующего спектру поглощения метаболита с максимумом флуоресценции 660 нм. Получены данные по эффективности использования двойного последовательного облучения (сначала при 565 нм, а затем при 640 нм) порфирин-содержащих микобактерий и целесообразности применения фотопродукта копропорфирина в качестве дополнительного фотосенсибилизатора для инактивации микобактерий. Получены данные по накоплению флуоресцирующих тетрапироллов в биопленках и органах мышей в условиях введения АЛК. Было выявлено, что при добавлении АЛК в биопленках в два раза возрастало количество порфиринов. В отличие от планктонной культуры M. tuberculosis, в биопленках, растущих без добавления АЛК также присутствуют свободные порфирины. Был подобран оптимальный способ введения АЛК для детектируемого накопления порфириновой флуоресценции в инфицированных микобактериями тканях мыши. При этой схеме ткани здоровых мышей не накапливали порфирины. Проведена антимикробная фотодинамическая терапия гомогенатов органов мышей с последующими высевами для оценки эффективности светового воздействия. Получены данные по эффективности светового воздействия в отношении биопленок M. tuberculosis, выращенных с и без АЛК. Установлено, что при пероральном введении АЛК в организм мыши происходит формирование фоточувствительных микобактерий в легких животных с острой туберкулезной инфекцией. В случае хронического туберкулеза происходит образование фоточувствительных микобактерий в легких мышей без введения АЛК. Влияния АЛК в этом случае не наблюдалось, вероятно, из-за низкой метаболической активности микобактерий в период хронической формы заболевания.