Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Экспериментальные исследования in vivo. Цель данного этапа работы: уточнить роль воспаления в формировании нейрональных агрегатов α-синуклеина (a-Syn) – основного молекулярного субстрата болезни Паркинсона (БП). На лабораторных крысах-самцах Вистар отработаны оптимальные дозировки нейротоксина ротенона для воспроизведения начальной стадии БП (не только характерных моторных, но и немоторных проявлений заболевания). Показано, что морфологическим субстратом нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта у этих животных является снижение плотности нервных волокон в мышечной оболочке и межмышечном сплетении кишечника, с дозо-зависимым накоплением a-Syn в миентеральных ганглиях. Полученные данные демонстрируют, что развитие синуклеинопатии в ответ на системное действие ротенона начинается уже с уровня периферических миентеральных вегетативных нейронов. Установлено, что интранигральное введение крысам липополисахарида бактериальной стенки грамотрицательных бактерий (ЛПС) приводит к появлению на контралатеральной стороне тела паркинсонических двигательных нарушений, что подчеркивает самостоятельную роль нейровоспаления как триггера дегенеративного процесса и позволяет использовать эту модель для изучения характерной латерализации симптомов в дебюте БП. Показано, что индукция нейровоспаления в черной субстанции после введения ЛПС приводит к манифестации патологии a-Syn на стороне введения – это подтверждает сходство данной модели с молекулярным патогенезом БП. Накопление a-Syn сопровождается снижением числа дофаминергических нейронов, увеличением количества микроглии, активацией астроцитов по нейротоксическому фенотипу и изменением экспрессии и распределения белков семейства аквапоринов и коннексинов (AQP4, Сx43). 2. Экспериментальные исследования in vitro. Работа по данному разделу направлена на создание новой технологии оценки макромолекулярного краудинга клеток, «нагруженных» аберрантным а-Syn, у пациентов с БП, что может стать моделью и для других нейродегенераций (церебральных протеинопатий) с накоплением аномально агрегированных белков. В 2022 году был выполнен полный цикл конструкторских работ, связанных с созданием специального комплекса для самосборки клеток крови человека с целью оценки диэлектрической проницаемости и межклеточного взаимодействия лимфоцитов во внешних вращающихся электрических полях (на основе экспериментальной установки "Tunable Colloids” и оптического пинцета MMI Cell Manipulator). В экспериментах с модельными частицами SiO2 были установлены оптимальные режимы воздействия при контактной и бесконтактной схемах подведения электрического поля (т.е. при наличии или отсутствии прямого контакта электродов с исследуемой суспензией). Показано, что эффективным режимом сборки для лимфоцитов является контактный способ с синусоидальным сигналом частотой 10 кГц и амплитудой до 40 В. Была преодолена проблема высокой адгезии лимфоцитов к стеклу, препятствующей их сборке, путем нанесения гидрофобных пленок на обезжиренные электроды (окунание и высушивание в муфельной печи). На основе созданной установки начаты эксперименты по сравнительной оценке самосборки лимфоцитов во внешних электрических полях с использованием оптического пинцета у пациентов целевых групп (БП и клинически здоровые лица). При изучении агрегации a-Syn в лимфоцитах периферической крови установили, что гиперэкспрессия a-Syn в клетках может достигаться с помощью длительного воздействия паракватом в дозо-зависимой манере, что сопровождается уменьшением количества живых лимфоцитов и ухудшением функционального состояния их митохондрий. Одновременное введение параквата и фибрилл a-Syn, полученных in vitro, оказывало более токсическое действие на клетки. Установлено, что общий и фосфорилированный a-Syn выявляются во всех исследованных культурах лимфоцитов, локализуясь диффузно, преимущественно в цитоплазме клеток, причем экспрессия a-Syn значимо выше во всех экспериментальных линиях по сравнению с контролем, но в наибольшей степени увеличивается в группе «паракват + а-Syn». С использованием технологии мультиплексного профилирования генной экспрессии (штрихкодирование на платформе Nanostring) изучена активность 760 генов, ассоциированных с процессами нейродегенерации, на лейкоцитах крови 29 пациентов с БП (в т.ч. 13 пациентов в начальной стадии без лечения – Н-БП и 16 в развернутой стадии на фоне приема леводопы – Р-БП), а также 16 лиц контрольной группы сопоставимого возраста и пола. При сравнении с группой контроля у пациентов с Н-БП было выявлено статистически значимое снижение экспрессии генов CDKN1A и CPT1B, а у пациентов с Р-БП – значимое повышение экспрессии гена LRP1. Уровень экспрессии гена СPT1B также значимо различался между группами Н-БП и Р-БП, будучи вдвое ниже при начальной стадии болезни (Н-БП). Проведенный ROC-анализ показал хорошую диагностическую значимость для всех трех дифференциально экспрессирующихся генов. Выявлена статистически значимая связь уровня экспрессии гена CPT1B с длительностью заболевания. С учетом биологической роли белковых продуктов выявленных генов, полученные данные указывают на митохондриальную дисфункцию как одно из ранних звеньев патогенеза БП, которое может реализовываться через взаимодействие а-Syn с мембраной митохондрий и участие в ряде ключевых клеточных процессов. 3. Клинические исследования. С целью проверки гипотезы о вовлечении блуждающего нерва (БлН) в распространение a-Syn из вегетативных нейронов кишечника в ЦНС была отработана методика ультразвукового исследования БлН на аппарате экспертного класса. Обследованы 40 пациентов с БП и группа контроля (32 сопоставимых по полу и возрасту здоровых человека). У пациентов-мужчин площадь поперечного сечения (ППС) левого БлН была значимо ниже, чем у мужчин группы контроля, в то время как для правого БлН достоверной разницы в величине ППС выявлено не было. Проведенный ROC-анализ установил в качестве порогового значения ППС левого БлН показатель 2,10 мм2, с чувствительностью и специфичностью модели 59,4 и 75,0%, соответственно. Была показана взаимосвязь ППС БлН с клинической формой заболевания: величина ППС левого БлН была значимо меньше при более тяжелой, акинетико-ригидной форме БП, и такая же тенденция отмечена для правого БлН. Полученные данные указывают на вовлечение БлН в патогенез БП и могут служить визуализационным подтверждением нейрогенного распространения a-Syn вдоль оси «кишечник–мозг». С целью косвенного анализа накопления a-Syn в черной субстанции среднего мозга была отработана методика оценки площади черной субстанции и уровня нейромеланина с использованием ультравысокопольной МРТ 3 Тесла и методов пост-процессинговой обработки изображений в программе Image-J – эта новая технологии обозначается как «нейромеланин-чувствительная МРТ» (НМ-МРТ). Для оценки эффективности НМ-МРТ в качестве биомаркера синуклеин-ассоциированной дегенерации среднего мозга было также впервые проведено сравнение данной технологии с методикой транскраниальной сонографии (ТКС), выявляющей у абсолютного большинства больных БП феномен гиперэхогенности черной субстанции. В основную группу были включены 40 пациентов с БП, в группу контроля – 20 сопоставимых по полу и возрасту здоровых добровольцев. При НМ-МРТ у пациентов с БП отмечалось значимое снижение площади черной субстанции с двух сторон, с пороговым значением 252,0 пикселей (определенном при ROC-анализе), что позволяет дифференцировать БП от нормы. Чувствительность и специфичность модели составили 90,0% и 92,5%, соответственно, что было сопоставимо с аналогичными показателями для методики ТКС. Показана умеренная обратная корреляция между площадью черной субстанции и тяжестью БП. При сравнении площади гиперэхогенного сигнала от черной субстанции по данным ТКС с ипсилатеральной площадью черной субстанции по данным НМ-МРТ была выявлена статистически значимая обратная корреляция как с правой, так и с левой стороны. По итогам первого года работы по проекту подготовлены 4 статьи в журналах, индексируемых в WOS/Scopus.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Экспериментальные исследования in vivo. Изучены комбинированные модели болезни Паркинсона (БП), индуцированные нейротоксинами паракватом и ротеноном в сочетании с интрацеребральным или системным (внутрибрюшинным) введением липополисахарида (ЛПС). Параллельно оценивался терапевтический эффект фармбиотика U21, полученного из бактериального штамма Limosilactobacillus fermentum U-21. Введение токсинов приводило к выраженным двигательным нарушениям и неврозоподобным реакциям у экспериментальных животных, с отчетливым эффектом потенциации при добавлении ЛПС. В веществе мозга экспериментальных животных отмечена гибель нейронов черной субстанции (ЧС), увеличение интенсивности окрашивания на альфа-синуклеин, активация микроглии и ряд других изменений. Интрацеребральное введение ЛПС вызывало также гибель эпителиальных клеток крипт в толстой кишке и повышение уровня альфа-синуклеина в миентеральных нейронах, а системное (внутрибрюшинное) введение ротенона вызывало снижение скорости опорожнения желудка и моторика тонкой кишки; при этом результаты внутрибрюшинного введения ЛПС, параквата и комбинированного введения параквата либо ротенона с ЛПС не отличались от контроля. Пероральный приём фармбиотика U-21 оказывал положительное влияние на исходы как изолированных токсических моделей БП (паракват, ротенон), так и (в меньшей степени) на исходы комбинированных моделей (токсин + ЛПС). Фармбиотик не влиял на степень повреждения нейронов ЧС у крыс с моделями БП, но при этом снижал накопление фосфорилированного альфа-синуклеина и провоспалительные изменения в веществе мозга. Наиболее яркий положительный эффект фармбиотика U-21 был получен в комбинированных моделях БП на уровне энтеральной нервной системы: фармбиотик достоверно снижал содержание фосфорилированного альфа-синуклеина в межмышечных ганглиях тонкой кишки практически во всех экспериментальных группах. Это представляется весьма важным для трансляции полученных данных в клинику, поскольку при БП наиболее ранние изменения с накоплением альфа-синуклеина наблюдаются как раз в вегетативных нейронах энтеральных сплетений. 2. Экспериментальные исследования in vitro. В 2023 году совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана были изучены межклеточные взаимодействия, диэлектрическая проницаемость и коллективное поведение лимфоцитов и нейронов (производных ИПСК от здоровых доноров и пациентов с БП) во внешних переменных электрических полях с использованием оптического пинцета. Пилотные эксперименты показали существенное различие в силе взаимодействия между лимфоцитами пациентов с БП и здоровыми добровольцами, однако результаты, полученные в более обширной выборке пациентов и здоровых лиц, оказались более гетерогенными. Показана также регистрация ряда других феноменов клеточного поведения, таких как формирование туннелирующих нанотрубочек между нейронами и их упругое растяжение при манипуляции с оптическим пинцетом. Таким образом, впервые продемонстрирована принципиальная возможность оценки взаимодействия клеток и их коллективного поведения во внешних переменных анизотропных электрических полях, что может отражать накопление в клетках альфа-синуклеина или иных аномально конформированных белков. Однако характер межклеточного взаимодействия пока не может служить диагностическим параметром у пациентов с БП, и требуются дальнейшие исследования для уточнения его биомаркерного потенциала. При проведении на платформе Nanostring мультиплексного анализа экспрессии генов, участвующих в функционировании митохондрий, на культурах дофаминергических нейронов из ИПСК пациентов с генетическими формами БП было выявлено снижение экспрессии генов, продукты которых связаны с активностью окислительного фосфорилирования, циклом трикарбоновых кислот, биосинтезом аминокислот, окислением жирных кислот, метаболизмом стероидов, гомеостазом кальция в клетке, утилизацией свободных радикалов. Показано также, что синуклеиновая наследственная форма БП (мутация в гене SNCA) имеет свой собственный транскриптомный «портрет» по сравнению с другими формами БП. Выявленные изменения экспрессии генных сетей подтверждают роль нарушений митохондриального гомеостаза в молекулярном патогенезе БП и могут способствовать разработке биомаркеров и поиску новых терапевтических мишеней. Показано, что при экспериментальной индукции процессов фибриллизации альфа-синуклеина в нейронах, несущих мутацци в генах БП (LRRK2, SNCA) с помощью введения рекомбинантных фибрилл альфа-синуклеина, обработки культур паракватом или их комбинированного воздействия токсичность для клеток усиливается при сочетанном введения фибрилл альфа-синуклеина и параквата. Средняя интенсивность флуоресцентного окрашивания на общий и фосфорилированный альфа-синуклеин также значительно повышается при комбинации воздействия фибриллами альфа-синуклеина паракватом. Анализ мультиплексной экспрессии связанных с митохондриями генов с использованием платформы Nanostring показал, что все три вида воздействия (альфа-синуклеин, паракват и их комбинация) ожидаемо вызывают увеличение экспрессии альфа-синуклеина в нейронах по сравнению с контролем. Аналогичное увеличение экспрессии в результате воздействия фибрилл альфа-синуклеина и параквата наблюдается для гена SQSTM1, участвующего в процессах аутофагии, а снижение экспрессии – для гена фосфоглицераткиназы 1, активаторы которой рассматриваются как перспективные мишени для нейропротекторной и апоптоз-ингибирующей терапии. Была снижена также экспрессия BNIP3, который участвует в рекрутировании белка паркина на наружную мембрану митохондрий и последующей митофагии. 3. Клинические исследования. В тканях (аутопсийные образцы 3 пациентов с БП), а также в лимфоцитах крови пациентов с БП и здоровых добровольцев были изучены изменения экспрессии ряда регуляторных микроРНК, которые предположительно вовлечены в молекулярный патогенез данного заболевания. Были получены 4 дифференциально экспрессирующихся микроРНК: miR-29c-3p (уровень повышен при БП), miR-7-5p (повышен) и miR-29a-3p (уровень снижен при БП), miR-30c-5p (снижен). Для комбинации указанных микроРНК значение площади под кривой (показатель AUC) при проведении ROC-анализа составило 0,793, что позволяет надежно разграничить случаи БП от здоровых добровольцев и рассматривать данную комбинацию в качестве потенциального диагностического биомаркера БП. При проведении ультразвукового исследования блуждающего нерва (БлН) был проведен анализ показателя площади поперечного сечения правого БлН в зависимости от заболевания, в результате которого не удалось выявить значимых различий между БП и фенотипически сходным заболеванием – мультисистемной атрофией (МСА). Площадь поперечного сечения левого БлН у пациентов с БП была статистически значимо ниже, чем в группе контроля и у пациентов с МСА. Имелась слабая корреляция между утончением БлН слева и площадью гиперэхогенной черной субстанции по данным транскраниальной сонографии. Пациенты с БП на 3-й функциональной стадии по шкале Хен–Яра, имеющие более выраженные двигательные нарушения и осложнения леводопа-терапии, характеризовались статистически значимо меньшей площадью нейромеланин-зависимого контраста от черной субстанции среднего мозга (в режиме нейромелан-чувствительной МРТ) по сравнению с пациентами на ранних стадиях болезни.