Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В первый год проекта проведена серия работ по введению новых генотипов чая в культуру in vitro (Каратум, №582, №619), микроразмножению каллусов и побегов, подготовке растений для эксперимента в горшечной культуре и расчистка полевой коллекции для моделирования дефицита азота в полевых условиях. Для моделирования дефицита азота в условиях in vitro был проведен предварительный эксперимент по подбору концентраций азота в питательных средах (полная доза, ½ дозы, ¼ дозы и 0 дозы, каждый вариант в 5-ти кратной повторности). В течение 3 месяцев проводили отборы растительных эксплантов (каллусов, листьев микропобегов) для биохимических и молекулярно-генетических анализов. Для моделирования дефицита азота в горшечной культуре вегетативно размноженные 3-х летние саженцы чая высаживали в инертный субстрат (песок) в 6-литровых контейнерах, систематический полив питательными растворами с фиксированной концентрацией элементов [0,5 мМ Ca(H2PO4)2, 3 мМ NH4NO3, 0,5 мМ CaCl2, 1,0 мМ К2SO4, 46 мкМ H3BO3, 0,6 мМ MgSO4, 9 мкМ MnSO4, 2 мкМ CuSO4, 9 мкМ ZnSO4, 2,6 мкМ Na2MoO4 и 30 мкМ Fe-ЭДТА] с концентрацией азота 0 мМ (N-дефицит) или 3 мМ NH4NO3 (контроль). В течение 5 месяцев проводили отборы почвенных (0-20 см) и растительных проб (листья молодого прироста) для биохимических и молекулярно-генетических анализов В полевом эксперименте использовали 2 экспериментальных плота: 1). Чайная плантация сорта Колхида, где с 1986 года изучается эффективность применения различных видов (N, P, K) и доз минеральных удобрений шагом (шаг азотных удобрений в течение всего периода - 0-70-90-120-200 кг д.в./га, а кодировка 0-1-2-3) было выделено 2 группы модельных растений, контрастных по уровню азотного питания в почве. 1-ая группа растений с многолетним дефицитом азота, где азотные удобрения не вносили 36 лет. 2-ая группа растений с оптимальной обеспеченностью почв и растений азотом за счет ежегодного применения азотных удобрений в дозе 240 кг/га д.в., содержание суммы аммиачного и нитратного азотов составляла 80-90 мг/кг. В течение вегетационного периода с май-июнь-июль-август-сентябрь проводили отборы почвенных (0-20 см) и растительных проб (листья молодого прироста) для биохимических и молекулярно-генетических анализов. 2) Коллекционный участок вегетативно размноженных мутантных форм чая, полученных методами радиационного мутагенеза в 1970х гг в Грузии. Участок заложен в Сочи (пос. УчДере) в 1980х гг (№619 тетраплоид, №582триплоид, с.Каратум анеупоид, Колхида диплоид и др – всего 36 форм). Азотные удобрения не вносились в течение 30 лет. В 2022 г. нами заложен эксперимент по внесению азотных удобрений и взяты первые образцы на анализ. В каждом из перечисленных экспериментов определяли накопление катехинов, теанина и кофеина в листьях методом ВЭЖХ, а также анализировали содержание азота в пробах почвы и растений спектрофотометрически методом кислотного озоления. Методом qRT-PCR анализировали относительный уровень экспрессии генов биосинтеза теанина, кофеина, катехинов в листьях. У каллусов чая сорта Колхида отмечено в 5 раз большее накопление теанина и в 2 раза большее накопление кофеина при норме азота, в сравнении с дефицитом азота в in vitro. При этом, дефицит азота приводил к снижению галлированных катехинов, но не простых катехинов. В многолетнем полевом эксперименте у сорта Колхида отмечена выраженная сезонная динамика: от мая к августу накопление катехинов существенно возрастало. У других генотипов в полевых условиях наиболее высокие показатели накопления теанина отмечены в мае, по сравнению с июнем, июлем, августом. Наиболее высокое содержание теанина отмечено у генотипов №619, №582 и сорта Колхида. При этом, дефицит азота не оказывал выраженного влияния на содержание кофеина. По содержанию простых катехинов из четырех мутантных форм выделился анеуплоидный сорт Каратум, а содержание галлированных катехинов было выше у тетраплоидного генотипа №619. При этом у обоих генотипов внесение азота несущественно увеличивало накопление катехинов в полевых экспериментах. В эксперименте с горшечными растениями установлено, что накопление теанина в листьях возрастает при внесении азота. При этом, сорт Колхида больше накапливает теанин, чем анеуплоидный Каратум. В горшечных экспериментах не было обнаружено выраженных различий между накоплением катехинов и кофеина у Колхиды и Каратума. В полевом эксперименте на сорте Колхида проведен транскриптомный анализ путем секвенирования в режиме парноконцевых прочтений 151+151 п.н. на приборе Illumina NovaSeq в ресурсном центре геномных исследований лабораторного комплекса Научного Центра Генетики и Наук о Жизни АНО ВО «Университет «Сириус». Выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены, проведен анализ обогащения генной онтологии GO, путей Киотской энциклопедии генов и геномов KEGG (gene set enrichment analysis/GSEA). Всего 1116 генов с повышенной экспрессией и 1958 генов с пониженной экспрессией было идентифицировано в трех отборах (Май, Июнь, Июль) у сорта Колхида при дефиците азота. Интересно, что только 21 общий ген был выявлено из всех дифференциально экспрессирующихся генов в трех сезонах отбора. В июле, в период засухи, отмечено минимальное количество дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГов) при сравнении двух вариантов N0 и N240. Однако, достоверное снижение экспрессии многих генов наблюдалось в Мае и в Июне 2022 на фоне дефицита азота. В мае большинство ДЭГов, относящихся к процессам репликации ДНК, митозу, росту и делению клеток, фотореспирации, биосинтезу глицерофосфолипидов, метаболизму амидов, биосинтезу и транспорту белков, окислительному фосфорилированию и фотосинтезу были достоверно подавлены в варианте с дефицитом азота. Однако, наблюдалась повышенная регуляция многих генов биосинтеза флавоноидов, фенилпропаноидов, каротиноидов, цитратного цикла, фенилаланина, никотинамида, аргинина, пролина, аскорбата, тирозина, триптофана, аланина, аспартата, глутамата. Кроме того, повышенная регуляция ряда генов, относящихся к процессам гидролазной, оксидоредуктазной и трансаминазной активности, трансферазы N-групп наблюдалась на фоне дефицита азота в майских образцах. Параллельно с этими работами, в первый год исследований по базам транскриптомных данных выявлены 40 генов, вовлеченных в ассимиляцию азота, регуляцию метаболизма катехинов, кофеина и теанина у чайного растения. Разработаны фланкирующие праймеры и амплифицированы полные сиквенсы 30ти из этих генов. Полученные фрагментные ДНК-библиотеки для 20ти мутантных генотипов чая секвенированы в режиме парноконцевых прочтений 76+76 п.н. на приборе Illumina MiSeq в ресурсном центре геномных исследований лабораторного комплекса Научного Центра Генетики и Наук о Жизни АНО ВО «Университет «Сириус». В общей сложности для каждой фрагментной ДНК-библиотеке было получено от 184 до 392 тыс. пар прочтений, после обработки которых были выявлены SNP- полиморфизмы в кодирующих и некодирующих участках генов. Наибольшее количество SNP-полиморфизмов в кодирующих частях отмечено у генов 4CL (4-coumarate-CoA ligase-like 9) (от 0 до 22 SNPs в зависимости от генотипа), AlaDC (Alanine decarboxylase) (от 0 до 5 SNPs), GS1.2 (glutamine synthetase nodule isozyme-like) (от 0 до 11 SNPs), NRT2.4 (high affinity nitrate transporter 2.4-like ) (от 0 до 12 SNPs), UFGT_b (UDPG-flavonoids glucosyltransferase, anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase 2-like) (от 0 до 10 SNPs), и WRKY57 (от 0 до 5 SNPs). Наиболее редкие SNPs обнаружены в генах LAR (у мутантных форм №1385, №1405, №3574, №536), AlaAT (№1467, №3986), FLS (№157), LHT1 (№157, №212, №3180, №527, №551, №582, Каратум), WD40 (№212, №2697, №507, №527, №536, №582, №619, №855, Каратум), ANS_a (№3574, №3986, №855), GDH2 (№507, №536, №619, Каратум), GDHa (№3574, №551), bHLH35 (№855) и количество идентифицированных SNPs у этих генотипов составило 1-4. На основе полученных данных проведен анализ генетических дистанций между 20-ю генотипами чая, включенными в анализ. В дальнейшем планируется сопоставить эти результаты с фенотипическими данными.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчетном году (2-ой год проекта) исследования проводили на базе нескольких экспериментов. 1) In vitro эксперимент с фиксированной концентрацией азота (N+ и N–) в питательных средах (каллусы и микропобеги чая 3-х генотипов чая – сорт Колхида, сорт Каратум, #582). После культивирования эксплантов в течение 2-х месяцев проведен отбор проб для химических и молекулярно-генетических исследований. 2) Опыт с вегетативно размноженными саженцами чая (2 сорта – Колхида и Каратум и 4 мутантные формы чая – #582, #619, #2264, #3823) при контролируемых концентрациях азота в песчаном субстрате. Базовый состав питательного раствора (рН 5,0–5,1): 0,5 мМ Ca(H2PO4)2, 0,5 мМ CaCl2, 1,0 мМ K2SO4, 46 мкМ H3BO3, 0,6 мкМ MgSO4, 9 мкМ MnSO4, 2 мкМ CuSO4, 9 мкМ ZnSO4, 2,6 мкМ Na2MoO4 и 30 мкМ Fe-EDTA. Растения (по 5–7 шт. каждого варианта «генотип-доза») поливали каждые два дня по 250 мл этого питательного раствора (вариант N–) или добавляли к нему 3 мМ NH4NO3 (контроль N+). Отборы проб листьев для химических и молекулярно-генетических исследований проводили дважды: через два и четыре месяца воздействия. 3) Полевые опыты с полновозрастными растениями чая коллекции ФИЦ СНЦ РАН с внесением азотных удобрений (варианты N0 и N240) на 4-х генотипах чая (сорт Колхида, сорт Каратум, мутантные формы #619 и #582). Анализировали спектральные вегетационные индексы и параметры флуоресценции хлорофилла с использованием приборов C-710s (CID Bio-Science) и JuniorPAM. Методом ВЭЖХ анализировали содержание в растительных пробах кофеина, теанина и катехинов. Содержание азота в листьях определяли спектрофотометрически. Секвенирование транскриптомов было выполнено компанией Bio-Intelligence Co. Ltd (Шэньчжэнь, Китай) на платформе Illumina Hi-Seq. Верификация результатов RNAseq проведена с методом qRT-PCR. NGS ключевых генов ассимиляции азота и вторичного метаболизма (UFGT_a, PIP, CHS, UFGT_b, AMT1.2, ANSa, bHLH36, NRT2.4, MYB7, WD40, ANS_b, F'3'5'Hb, GDH2, ANRb, ANRa, LHT1, F3’5’Ha, 4CL, MYB4, FLS, bHLH35, GS1.2, DFRa, AlaDC, GDHa, AlaAT1, LAR, bG, WRKY57) проводилось на базе НТУ Сириус. В экспериментах in vitro впервые для чайного растения получены биохимические и транскриптомные профили эксплантов, культивируемых в контрастных по азоту условиях. На фоне дефицита азота у микропобегов чая происходило достоверное снижение содержания галлохинной кислоты, галлокатехина, теобромина, кофеина и галокатехин галлата. У каллусов чая происходило достоверное снижение содержания L-теанина, теобромина и катехин галлата. В эксперименте in vitro GO-анализ показал наибольшее насыщение процессов фотосинтеза, оксалатного метаболизма и ответов на микроорганизмы (GO:0009768, GO:0009817, GO:0033609, GO:0015979). Также, большое количество ДЭГов было связано с транскрипцией и регуляцией транскрипции (GO:0006351, GO:0006355) (всего 272 гена с повышенной экспрессией и 137 генов с пониженной регуляцией со значением LogP ≥ 4). Наиболее высокий фактор насыщения отмечен для GO:0031409, GO:0016168, GO:0046564 (связывание пигментов, фотосинтез и оксалат декарбоксилазная активность, соответственно). В экспериментах in vitro выявлено 1733 значимых ДЭГов, из которых 558 были подавлены и 1175 активированы по сравнению с контролем. Из этих ДЭГов, 31 ДЭГ (14 с пониженной регуляцией) связаны с вторичным метаболизмом и 112 ДЭГов (33 с пониженной регуляцией) связаны с метаболизмом клеточной стенки. В вегетационном эксперименте впервые для чайного растения установлены 12 (из 36 изученных) наиболее информативных спектральных индексов с коэффициентом детерминации r ≥ 0.5 и уровнем значимости p < 0.001: ZMI, VREI1,2,3,TCARI, RENDVI, MDATT, GM1, GM2, Ctr2, CNDVI, ARI2, которые отражали состояние их фотосинтетического аппарата, содержание антоцианов, полифенолов, водный и азотный балансы. Установлено, что дефицит азота в наибольшей степени ингибировал биосинтез теанина (более одного порядка) и алкалоидов (кофеина и теобромина (в 3–5 и 2–3 раза, соответственно); при этом усиливал образование и накопление ряда катехинов и флаванолов (в среднем в 1,5–2 раза). При сопоставлении результатов анализов GO и KEGG выявлено, что фенилпропаноидный путь значительно обогащается при 2-х и 4-х месячном воздействии дефицита азота. При этом большая часть ДЭГов фенилпропаноидного пути подавлена у сорта Колхида, но активирована у сорта Каратум. Общие пути GO связаны со связыванием ионов металлов, активностью бета-глюкозидазы, окислительно-восстановительным гомеостазом клеток, ответом на микроорганизмы, биосинтезом полисахаридов, активностью гидролазы сложных эфиров карбоновых кислот. Всего 111 факторов транскрипции (ТФ) дифференциально экспрессировались у обоих генотипов при дефиците азота в горшечном эксперименте, из них повышенная экспрессия наблюдалась у следующих ТФ: ARF, AP2/ERF, NAC4, NAM-like protein, bZIP23, bHLH14, bHLH36, bHLH78, receptor-like protein 12, WRKY40, WRKY70, WUSCHEL-related homeobox like, zinc finger protein 2, zinc finger protein 3. Большинство этих ТФ относятся к АБК-зависимой реакции на стресс. Результаты проверки с помощью qRT-PCR соответствовали результатам RNAseq в обоих генотипах: большинство ДЭГов, которые лежат в основе биосинтеза флавонолов, были значительно подавлены у растений сорта Колхида, однако некоторые из них были активированы у сорта Каратум после 4-месячного дефицита, а именно FLSa, CHS, F3’5’H, F3’H, DFR, CHI. Дефицит азота у растений сорта Каратум влиял на фенилпропаноидный путь в меньшей степени, и, как следствие, отмечена большая стабильность биосинтеза катехинов по сравнению с сортом Колхида. Состав реконструированных генных сетей пересекается по 16 генам, их регуляция в ответ на дефицит азота представлена в таблице (См. слайд 33 – Файл-приложение к отчету). Регуляция транскрипции этих генов демонстрирует тесную отрицательную корреляцию между параметрами растений сортов Колхида и Каратум (r = – 0,77, при p <0,05). В полевом эксперименте между содержанием азота в растениях и их биохимическими параметрами (L-теанин, кофеин) установлены тесные прямые корреляционные связи. Выявлены SNP-полиморфизмы в генах чая, вовлеченных в ассимиляцию азота, регуляцию азотного метаболизма и генов метаболизма катехинов, кофеина и теанина в коллекции из 32х мутантных форм чая. Установлены достоверные ассоциации между несколькими SNPs и биохимическими соединениями (теафлавин, L-теанин и эпикатехин галлат). Среди них семь SNPs умеренного действия могут привести к замене аминокислоты в конечном белке в следующих генах ANSa, GDH2, 4Cl, F3’5’Hb, UFGTa. Анализ различий транскриптомных профилей между четырьмя генотипами чая (Колхида (диплоид), 582 (триплоид), 619 (тетраплоид), Каратум (триплоид)) на фоне дефицита азота в весенний период показал наибольшее количество дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) у сорта Каратум (1954), а наименьшее – у тетраплоидного генотипа №619 (304) и у №582 (511) в сравнении с сортом Колхида. Из них, были подавлены примерно 66 %, 47 % и 44 % у генотипов Каратума, №619 и №582, соответственно, в сравнении с Колхидой. Достоверно дифференциально экспрессирующиеся гены при дефиците азота были выявлены у всех сортов. Так, у генотипов №619 и Каратум большая часть их повышено экспрессировалась в варианте N0 по сравнению с контролем N240, а у Колхиды и №582 – понижено экспрессировалась, что показывает более высокую устойчивость к дефициту азота у первых двух генотипов. Все данные RNAseq за отчетный период загружены в базу данных открытого доступа China National Gene Bank Database (The project accession number: CNP0004775). Все данные секвенирования генов коллекции чая загружены на NCBI Проект № PRJNA977584 (данные, полученные в 2022 г.) и № PRJNA1015448. Эти новые данные геномного секвенирования широкого спектра редких северных генотипов чая пополнили существующие международные базы данных, что является значимым вкладом в мировую науку и имеет большую теоретическую значимость.