КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-16-00128
НазваниеИзучение токсического действия глифосатов на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, их рост и развитие и разработка биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата
РуководительЛаптев Георгий Юрьевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Общество с ограниченной ответственностью "БИОТРОФ+", г Санкт-Петербург
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии
Ключевые словаглифосат, микробиом кишечника, транскриптом, цыплята-бройлеры, сельскохозяйственная птица, биодеградация
Код ГРНТИ68.03.07
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Настоящий проект направлен на изучение токсического действия глифосатов на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, их рост и развитие, а также разработку биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата.
Глифосат - наиболее распространенный и широко используемый гербицид широкого спектра действия, который блокирует ключевой фермент шикиматного пути 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), участвующий в синтезе трех незаменимых ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) у большинства прокариот, растений и грибов.
В настоящее время имеются отдельные научные исследования о негативном влиянии глифосата на живые организмы, которые убедительно показали токсическое действие глифосата на организм животных и птиц в том числе. Отрицательное влияние связано с цитотоксическим и канцерогенным эффектом глифосата и с воздействием на эндокринную и репродуктивную функции. Кроме этого глифосат негативно влияет на микробные сообщества кишечника, нарушая пищеварительную функцию и снижая устойчивость заболеваниям. Одной из проблем использования глифосата, наряду с его токсическим действием на нецелевые организмы, является усиление устойчивости растений к нему и, соответственно, увеличение эффективных концентраций, что приводит к высоким количествам глифосата и в кормах сельскохозяйственных животных, а также к повышению общей токсичности.
В ряде экспериментов in vitro показана чувствительность к глифосату ключевого фермента EPSPS у большинства микроорганизмов, а также выявлена взаимосвязь между строением фермента и его чувствительностью к глифосату. Примечательно, что часто устойчивыми ферментами обладают именно патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.
Актуальность и значимость проекта заключаются в необходимости расширения имеющихся представлений о воздействии глифосатов на физиологические и биохимические процессы, поскольку имеющиеся на сегодняшний день сведения о влиянии глифосата на птицу фрагментарны. Действие глифосатов на микроорганизмы также ранее исследовалось преимущественно в опытах in vitro.
В рамках рассматриваемого проекта впервые предлагается проведение первого комплексного исследования влияния токсического действия глифосата на организм птицы, включая симбиотические микробиомы кишечника и их функционирование, транскрипцию генов иммунитета и продуктивности птиц, их процессы пищеварения, иммунобиологический, биохимический статус, рост и развитие в экспериментах in vivo. В частности, будет рассмотрено влияние различных концентраций глифосатов, а также исследовано сочетанное действие глифосата и антибиотиков, поскольку существуют работы, говорящие об усилении антибиотикорезистентности микроорганизмов к ряду антибиотиков на фоне глифосата.
Решением этой проблемы могло бы стать использование биопрепаратов на основе микроорганизмов-деструкторов глифосата. Микроорганизмы является надежным и экологическим инструментом в ремедиации. Поэтому разработка новых безопасных препаратов для разложения глифосатов и снижения токсической нагрузки на организм животных является очень актуальной в настоящее время.
Научная новизна проекта определяется следующим:
1) впервые будет изучено токсическое влияние глифосата на птицу, в т.ч. в различных концентрациях, а также при сочетании с антибиотиками в кормах на состав и функциональное состояние микробиома слепых отростков кишечника с применением комплекса молекулярно-генетических методов NGS-секвенирования;
2) впервые будут получены результаты оценки пула генов ферментов, ассоциированных с биодеградацией глифосата, в микробиоме кишечника птицы при различных концентрациях глифосата, а также при сочетании с антибиотиками в кормах;
3) впервые будут исследованы особенности влияния сочетания глифосата с антибиотиками в кормах на усиление свойств антибиотикорезистентности в микробиоме кишечника птицы;
4) впервые будет оценена экспрессия ключевых генов, ассоциированных с иммунитетом и продуктивностью птицы, на фоне различных концентраций глифосата, а также присутствия / отсутствия антибиотиков в кормах;
5) впервые будут оценены показатели роста, развития птицы, активность пищеварительных ферментов (амилазы, липазы и протеаз) в тонком отделе кишечника и крови, а также биохимические, гематологические и иммунобиологические показатели крови при различных концентрациях глифосата, а также на фоне присутствия / отсутствия антибиотиков в кормах;
6) впервые будут определены маркеры токсического воздействия глифосатов на птицу при контаминации ими корма, что послужит фундаментальной основой разработки приемов нейтрализации глифосатов;
7) впервые будет разработан эффективный бактериальный препарат-биодеструктор глифосатов с пробиотическими свойствами.
Выполнение проекта, сочетающего междисциплинарный комплексный подход к изучению рассматриваемой проблемы, позволит получить новые знания и практические результаты для разработки способов нейтрализации глифосатов с целью получения качественной продукции животноводства.
Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты исследования будут иметь высокую фундаментальную и прикладную значимость, поскольку позволят впервые в мире получить комплексное представление о влиянии глифосата на состав и функциональное состояние микробиома, пищеварение, рост и развитие птиц.
При выполнении проекта будут получены результаты, имеющие научную новизну и высокую значимость мирового уровня.
1) Впервые будет изучено токсическое влияние глифосатов в различных концентрациях, а также в сочетании с антибиотиками, на состав и функциональное состояние микробиома слепых отростков кишечника с применением комплекса современных и высокоинформативных молекулярно-генетических методов NGS-секвенирования, включая таргетный анализ генов 16S РНК и полногеномный анализ. Это позволят глубоко изучить воздействие глифосатов на микробиом птицы и выявить микроорганизмы, чувствительные или устойчивые к действию пестицида при его различных концентрациях в кормах, а также на фоне применения антибиотиков.
2) Впервые по данным полногеномного NGS-секвенирования будет охарактеризован спектр генов ферментов, связанных с биодеградацией глифосатов в микробных сообществах кишечника птицы в ответ на контаминацию корма глифосатов в различных концентрациях, а также в сочетании с антибиотиками. Результаты, полученные при помощи биоинформатического анализа полногеномных данных с использованием сервера для определения класса и чувствительности ключевого фермента шикиматного пути EPSPS (5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза) к глифосатам (http://ppuigbo.me/programs/EPSPSClas), позволят оценить устойчивость микробных сообществ кишечника птицы к глифосатам при различных условиях.
3) Впервые будет установлено глифосатов на экспрессию ключевых генов, ассоциированных с иммунитетом и продуктивностью птицы, на фоне различных концентраций глифосатов и в сочетании с антибиотиками в кормах. Применение методов дифференциальной экспрессии генов методом полногеномного NGS-секвенирования и отдельных генов методом количественной ОТ-ПЦР позволит проследить закономерности ответа птицы на контаминацию кормов глифосатами и составить перечень реагирующих на них генов-маркеров в тканях печени, слепых отростков ЖКТ, бурсы. Наибольший интерес для изучения токсического действия глифосатов представляют гены, ассоциированные 1) с врожденным иммунитетом (такие как бета-дефензины Gal-9, Gal-10, Gal-11, цитокины IL6, IL8, цистеиновая протеаза CASP6, простагландин-эндопероксид-синтаза-2 (циклооксигеназа 2) PTGS2, регуляторный фактор интерферона 7 - IRF7), 2) с синтезом антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы SOD, глутатионпероксидазы GSH-P X, гемоксигеназы-1, каталазы), 3) с факторами роста (инсулиноподобные факторы роста IGF1, миостатин, 4) защитными факторами (Toll-подобные рецепторы, муцин (например, MUC-2), 5) транспортом и метаболизмом питательных веществ (транспортеры глюкозы SGLT и др.).
4) Впервые в условиях экспериментов in vivo в условиях хронических опытов на птице будет исследовано сочетанное действие глифосатов и антибиотиков. В рамках исследования будет проверена гипотеза об усилении антибиотикорезистентности микроорганизмов к ряду антибиотиков на фоне глифосатов.
5) Впервые будет продемонстрировано влияние глифосатов на активность пищеварительных ферментов (амилазы, липаз, протеаз) в тонком отделе кишечника и крови, что позволит охарактеризовать взаимосвязь между различными концентрациями пестицида в кормах и их воздействием на пищеварительные процессы у птиц. Помимо этого, будет прослежена взаимосвязь между токсическим эффектом глифосатов, кишечным микробиомом и активностью пищеварительных ферментов.
6) Будет оценено влияние глифосатов на биохимические, гематологические и иммунологические показатели крови, что позволит оценить его степень воздействия на показатели здоровья и иммунитета птицы.
7) Впервые будут определены микробиологические, биохимические и физиологические маркеры токсического воздействия глифосатов на птицу при контаминации ими корма, которые могут быть широко востребованы для развития отрасли птицеводства и разработки приемов нейтрализации глифосатов.
8) Будет охарактеризована степень воздействия различных концентраций глифосатов, в т.ч. в сочетании с антибиотиками на динамику роста и развития птицы.
9) С целью разработки биопрепарата для нейтрализации токсического эффекта глифосатов будет создана коллекция штаммов бактерий-биодеструкторов глифосатов, включающая не менее 30 штаммов. По результатам экспериментов in vitro будут отобраны перспективные штаммы, которые показали наибольшую активность к биодеструкции различных концентраций глифосатов, в т.ч. на фоне условий, имитирующих по уровню кислотности среды различные отделы кишечного тракта.
10) Будут получены и проанализированы результаты секвенирования геномов наиболее перспективных штаммов-биодеструкторов методом NGS. Наибольший интерес представляет определение класса и чувствительности ключевого фермента шикиматного пути EPSPS, которые будут проанализированы с применением сервера http://ppuigbo.me/programs/EPSPSClas. Помимо этого будут оценены потенциальные пробиотические свойства штаммов (синтез бактерицинов, антимикробных соединений и др.), а также метаболические пути синтеза биологически активных, антимикробных веществ, витаминов, ферментов, способствующих разложению клетчатки, токсичных соединений и пр.
11) Будут оценены пробиотические свойства штаммов по способности к антагонистическому подавлению ряда условно-патогенных и патогенных видов микроорганизмов.
12) Будут получены результаты характеристики культуральных и технологических свойств штаммов и получена опытная партия биопрепарата-деструктора глифосатов. В частности, будут оцениваться совместимость штаммов с подкислителями и антибиотиками, сохранность при различных температурных режимах (4°С и 25°С), выживаемость при длительном хранении, биотоксичность на инфузориях, оптимальные питательные среды для культивирования. Будут разработаны биотехнологические формы препарата для использования в промышленных условиях (жидкая форма, твердая форма, лиофильная сушка). Для получения опытной партии биопрепарата будет выбран наиболее активный штамм, обладающий оптимальными технологическими характеристиками и биотехнологическим потенциалом.
13) В условиях эксперимента in vivo будут получены результаты апробации разработанного биопрепарата-деструктора глифосатов на фоне различных концентраций пестицида, а также в сочетании с антибиотиком. В эксперименте будет оценена эффективность биопрепарата деструктора глифосатов на состав и функциональное состояние микробиома кишечника, а также представленность в нем спектра ферментов шикиматного пути EPSPS с определением их класса и чувствительности. Будут получены результаты применения биопрепарата деструктора глифосата на экспрессию генов иммунитета и продуктивности птиц, активность пищеварительных ферментов показатели здоровья и иммунитета, а также показатели роста и развития птиц.
14) Подготовлены рекомендаций, обобщающие по воздействию глифосатов на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, их рост и развитие, а также применению биопрепарата-биодеструктора для нейтрализации токсического действия глифосата.
Таким образом, предлагаемый проект имеет максимальную актуальность, фундаментальную и практическую значимость, и позволит российской науке занять передовые позиции в области изучения воздействия глифосатов на сельскохозяйственную птицу. Проведенные фундаментальные исследования позволят существенно продвинуться в направлении поиска методов своевременной идентификации интоксикации глифосатами у птиц и мер их нейтрализации, а также разработать эффективный биопрепарат на основе штаммов-биодеструкторов данного пестицида. Основное действие препарата направлено на нейтрализацию токсического действия глифосатов, в частности, на коррекцию состава и функционирование микробных сообществ ЖКТ птиц, повышение резистентности их организма и продуктивных показателей. Полученные данные позволят внедрить новый препарат в промышленные циклы производства птицеводческой продукции в качестве новых биотехнологических элементов производственного процесса для физиологически адекватной и эффективной коррекции токсического состояния у птиц, который позволит нивелировать негативное действие глифосатов на микробиом.
Ожидаемые по тематике проекта результаты исследований сопоставимы с мировым уровнем и могут быть использованы в практике. Практический эффект использования разработанного биопрепарата-биодеструктора глифосатов будет представлять большое значение не только сельского хозяйства, но и для биомедицинских исследований, поскольку проблема контаминации продукции растениеводства глифосатами имеет также высокую актуальность для здоровья человека.
Достижимость результатов обусловлена широким опытом коллектива в исследовании профиля и функций микробных сообществ сельскохозяйственных животных, а также в разработке биопрепаратов на основе микроорганизмов, с антагонистической активностью, целлюлозолитическими свойствами, биодеструкции токсичных соединений (в частности, микотоксинов). В распоряжении научного коллектива имеется необходимая материальная база мирового уровня, статистические и биоинформатические программы для анализа полученных результатов.
Руководитель проекта и члены коллектива имеют значительный опыт в публикации результатов молекулярно-генетических исследований в индексируемых в базах данных «Скопус», «Сеть науки», в частности из перечня Q1 и Q2.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект направлен на изучение токсического действия глифосатов на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, их рост и развитие, а также разработку биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата. Глифосат - наиболее распространенный и широко используемый гербицид широкого спектра действия, который блокирует ключевой фермент шикиматного пути 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), участвующий в синтезе трех незаменимых ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) у большинства прокариот, растений и грибов.
1 ЧАСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ направлена на изучение токсического влияния на птицу различных концентраций глифосата в кормах.
Для этого был выполнен эксперимент на птице бройлеров кросса Росс 308, в ходе которого проведена искусственная контаминация кормов глифосатом в количестве, соответствующем следующим значениям ПДК: 0,5 ПДК (10 мг/кг корма), 1 ПДК (20 мг/кг), в 5 раз выше (100 мг/кг) с учетом фоновой концентрации глифосатов в кормах. На 1, 7, 14 и 35 сутки эксперимента проводили отбор индивидуальных проб содержимого слепых отростков для таргетного секвенирования бактериального гена 16S рРНК и полногеномного секвенирования микробного сообщества, а также отбор тканей кишечника, бурсы и печени для оценки экспрессии генов и проведения полнотранскриптомного анализа.
Таргетное секвенирование микробиома кишечника по гену 16SрРНК показало, что под действием глифосата происходило снижение доли бактерий, обладающих положительным влиянием на здоровье птицы и накопление патогенных видов, особенно у птиц, получавших в рационе глифосат в концентрации более ПДК (20 мг/кг).
Функциональные отличия в микробиоме, возникающие под влиянием глифосата, были выявлены на уровне гликолитических ферментов путей, ответственных за метаболизм простых углеводов (КО00010). Произошла элиминация ряда генов ферментов, участвующих в пути Эмбдена-Мейергофа. При добавлении к рациону птицы глифосата в концентрации выше ПДК происходила элиминация фосфодиэстераз в микробном сообществе, таким образом, глифосат может приводить к увеличению концентрации вторичных мессенджеров и нарушению передачи сигналов между клетками. Даже низкие концентрации гебицида приводили к снижению разнообразия гликолитических ферментов. В микробиоме опытных птиц снижение разнообразия происходило в обратной зависимости от концентрации глифосата. Подобные изменения опосредовано могут приводить к снижению эффективности пищеварительных процессов переваривания корма птицей и снижению уровня энергетического метаболизма.
Таким образом, глифосаты оказывают значительное влияние на микробиом кишечника птицы, особенно в концентрациях выше ПДК, способствуя накоплению патогенов и снижению эффективности пищеварительных процессов.
Анализ экспрессии генов показал, что добавление в корм глифосата снижало экспрессию генов продуктивности и иммунитета птицы в слепых отростках, бурсе и печени. Анализ полного транскриптома слепых отростков кишечника птиц выявил широкий спектр биохимических процессов, которые оказались подвержены влиянию глифосатов. Высокие дозы глифосата (100 мг/кг) привели к снижению уровня цитохром С оксидазы, что может проявляться в нарушении энергетического метаболизма в тканях кишечника, связанного с функционированием электрон-транспортной цепи в митохондриях клеток. Отмечено изменение транскрипции генов цитокинов, принимающих участие в развитии воспалительных реакций (IL1β, IL4, IL7, IL8, IL10, IL15, IL18, IL22). Заметно возрастала доля белков, участвующих в процессах клеточного апоптоза (каспаз) и процессах внутриклеточной деградации белков (убиквитина С). Также изменения затронули регуляторные механизмы передачи сигналов, связанные с транспортом кальция, белки антиоксидантной системы и различные факторы роста.
По данным эксперимента, глифосат оказал выраженный негативный эффект на показатели роста и развития птицы, связанные со снижением прироста живой массы, показателями массы печени и кишечника, а также длины кишечника по сравнению с контролем. При исследовании биохимических и гематологических показателей крови цыплят отмечен ряд отклонений, свидетельствующих о токсическом действии глифосата на организм птицы. В частности, на фоне глифосата детектировано снижение эритроцитов и гемоглобина, α-глобулина, амилаз. Было выявлено нарушение иммунных реакций, которое может приводить к повышенной частоте и тяжести инфекционных и оппортунистических инфекций поголовья. Анализ активности пищеварительных ферментов (амилазы, липазы и протеаз) показал, что потребление птицей корма, зараженного глифосатом, привело к скачкообразным изменениям активности ферментов химуса и крови, что в совокупности указывает на наличие существенной нагрузки на пищеварительную систему.
Таким образом, несмотря на кажущуюся безопасность глифосатов для животных, даже небольшие концентрации глифосатов оказали негативное влияние как на процессы пищеварения, так и на состояние здоровья опытных птиц. Уровень негативного воздействия возрастает с увеличением концентрации гербицида.
2 ЧАСТЬ ИСЛЕДОВАНИЙ направлена на разработку биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата.
На данном этапе была создана коллекция штаммов - биодеструкторов глифосатов. Среди 30 исследованных штаммов различных культур микроорганизмов были выявлены пять штаммов являющихся перспективными в отношении способности к биотрансформации глифосата. Выбранные штаммы бактерий при этом также обладали необходимыми технологическими свойствами и могут быть использованы как пробиотические штаммы. Выбранные штаммы Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Bacillus mucilaginosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri утилизировали от 17 до 48% глифосата, первоначально содержащегося в пробе. Штаммы Bacillus subtilis и Enterococcus faecium продемонстрировали наибольшую способность к биодеструкции глифосата в условиях модуляции среды кишечника.
Публикации
1. Дубровин А.В., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Пономарева Е.С., Калиткина К.А., Лаптев Г.Ю. Иммунный статус промышленной птицы на предприятиях: обзор Птицеводство, 2022. – №5. – С. 49-54. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.33845/0033-3239-2022-71-5-49-54
2. Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Тюрина Д.Г., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Дубровин А.В., Новикова Н.И., Меликиди В.Х., Горфункель Е.П., Пономарева Е.С., Околелова Т.М. Чем опасен глифосат? Птицеводство, 2022 г., №7-8, с.33-39 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.33845/0033-3239-2022-71-7-8-37-42
3. Лаптев Г.Ю., Тюрина Д.Г., Горфункель Е.П., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Дубровин А.В., Бражник Е.А., Новикова Н.И., Дуняшев Т.П., Меликиди В.Х., Калиткина К.А., Пономарева Е.С. Влияние глифосата и пробиотика на микробиом цыплят-бройлеров Птицеводство, 2022 г., №.11, с.35-44 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.33845/0033-3239-2022-71-11-35-43
4. Тюрина Д.Г., Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Бражник Е.А., Калиткина К.А., Пономарева Е.С., Дубровин А.В., Новикова Н.И., Ахматчин Д.А., Молотков В.В., Меликиди В.Х., Горфункель Е.П. Изменение экспрессии генов антимикробных пептидов у сельскохозяйственной птицы под влиянием глифосата и пробиотика Аграрная наука, - (год публикации - 2022)
5. Тюрина Д.Г., Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Бражник Е.А., Тарлавин Н.В., Калиткина К.А., Пономарева Е.С., Ахматчин Д.А., Молотков В.В, Меликиди В.Х., Горфункель Е.П. ВЛИЯНИЕ ВВЕДЕНИЯ В КОРМ АНТИБИОТИКОВ, ГЛИФОСАТА И ШТАММА МИКРООРГАНИЗМА Bacillus sp. НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ КРОССА РОСС 308 Сельскохозяйственная биология, - (год публикации - 2022)
6. Тюрина Д.Г., Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Молотков В.В. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С ПРОСТАГЛАНДИНАМИ, У БРОЙЛЕРОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГЛИФОСАТА И ПРОБИОТИКА AIP Conference Proceedings, - (год публикации - 2022)
7. Дубровин А.В., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Пономарева Е.С., Калиткина К.А., Лаптев Г.Ю. ВЛИЯНИЕ ГЛИФОСАТА В КОРМАХ НА ЗООТЕХНИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ Материалы Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённой 135-летию со дня рождения А.Н. Костякова, 2022 г., Т.2., с. 608-612 (год публикации - 2022)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Пестициды и антибиотики во многих случаях незаменимы для современного сельскохозяйственного производства. Глифосат - наиболее распространенный и широко используемый гербицид широкого спектра действия, который блокирует ключевой фермент шикиматного пути 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), участвующий в синтезе трех незаменимых ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) у большинства прокариот, растений и грибов. Совместное влияние пестицидов, антибиотиков и других ксенобиотиков может привести к негативным эффектам для организма животных и человека.
Проект направлен на изучение токсического действия глифосатов на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, их рост и развитие, оценку влияния совместного использования антибиотиков, а также разработку биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата.
На прошлом этапе мы показали, что поступление глифосатов с кормами в количестве, даже ниже, чем ПДК для кормов, – это стрессовый фактор, который оказывает разноплановое влияние на некоторые важные показатели физиологии, микробиоценоза и продуктивности бройлеров. За развитием патологий, связанных с глифосатом, могут стоят как прямые патологические изменения, так и нарушения транскриптома, а также состава микробиома. На данном этапе мы оценили совместное влияние глифосата и антибиотиков на функциональное состояние микробного сообщества кишечника птиц, а также организма цыплят-бройлеров.
1 ЧАСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ была направлена на изучение совместного влияния на птицу глифосата в кормах и применения антибиотиков.
Для этого был выполнен эксперимент на птице бройлеров кросса Росс 308, в ходе которого проведена искусственная контаминация кормов глифосатом в количестве, соответствующем 1 ПДК (20 мг/кг). Было сформировано 4 группы бройлеров: I - контрольная, которая получала основной рацион (ОР), II опытная - ОР с добавлением глифосата (ГФ); III опытная - ОР с добавлением глифосата и ветеринарных антибиотиков энрофлоксацина и метансульфоната колистина (ГФ+АБ1); IV опытная - ОР с добавлением глифосата и аммония мадурамицина (ГФ+АБ2).
Секвенирование микробиома слепых отростков по фрагменту гена 16S рРНК показало, что в опытных группах по сравнению с контролем увеличивалась численность Clostridia, известных своей устойчивостью к действию неблагоприятных факторов. Также обращает на себя особое внимание, что количество представителей Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Oscillospiraceae, Butyricicoccaceae, ферментирующих клетчатку и образующих ценные летучие жирные кислоты, напротив снижалось практически во всех опытных группах. Измененная глифосатом и антибиотиками микробиота кишечника может негативно влиять на химическую трансформацию ксенобиотиков в организме хозяина, а также на процессы пищеварения.
Отличия в микробиоме, возникающие под влиянием глифосата были выявлены на уровне гликолитических ферментов путей, ответственных за метаболизм простых углеводов (КО00010). Под влиянием глифосата и глифосата с антибиотиками произошло снижение числа обнаруживаемых ферментов, участвующих в данном метаболическом пути. Были выявлены отличия между группами по разнообразию выявленных ферментов, участвующих в синтезе сидерофоров бактерий. Наименьшее число сидерофоров было выявлено в контрольной группе – бацилибактин и пиохелин. В остальных группах было выявлено намного больше генов. Были выявлены бацилибактин, пиохелин, вибриобактин, энтеробактин, миксохелин. Также в группах, подверженных влиянию глифосата был выявлен фермент 2,3-дигидро-2,3-дигидроксибензоатдегидрогеназа. Это ген, который необходим для биосинтеза 2,3-дигидроксибензойной кислоты, которая включена в структуру большого числа сидерофоров.
Анализ наличия гликозилгидролаз, участвующих в разложении простых и сложных углеводов, по базе Cazy выявил снижение разнообразия данных ферментов под влиянием глифосата и антибиотиков в микробиоме слепых отростков опытных групп. Подобные изменения опосредовано могут приводить к снижению эффективности пищеварительных процессов переваривания корма птицей и снижению уровня энергетического метаболизма. Различия наблюдались по 18 семействам гликозилгидролаз.
Таргетный анализ экспрессии генов показал, что добавление в корм глифосата снижало экспрессию генов продуктивности и иммунитета птицы в слепых отростках, бурсе и печени.
Анализ полного транскриптома слепых отростков кишечника птиц показал, что у птиц опытных групп повышался уровень транскрипции цитохрома С 450 (цитохром P450-зависимая монооксигеназа). В группах III и IV повышение было более значимым, что вероятно связано, с необходимостью детоксикации в печени дополнительной лекарственной нагрузки в виде различных антибиотиков. Система цитохрома P450 участвует в окислении многочисленных соединений, как эндогенных, так и экзогенных, а также в нейтрализации ксенобиотиков (лекарств, ядов).
Можно отметить, несомненное влияние глифосата на функционирование иммунной системы птиц, которое заключалось в изменении спектра транскрибируемых генов. Отмечено изменение транскрипции генов цитокинов, принимающих участие в развитии воспалительных реакций (IL1, IL4, IL7, IL8, IL11, IL15, IL18, IL34). Также были отмечены различия в экспрессии контрольной и опытных групп таких генов белков антиоксидантной защиты как: глутатион-трансфераза, простагландин эндопероксид синтаза, супероксиддисмутаза.
Анализ наличия детерминант антибиотикорезистености показал, что их уровень был ниже в контроле. К повышению уровня генов антибиотикорезистентности привело применение как антибиотиков в совокупности с глифосатом, так и применение глифосата в чистом виде.
По данным эксперимента, глифосат в концентрации 20 мг/кг оказал некоторый негативный эффект на показатели роста и развития птицы, связанные со снижением прироста живой массы, показателями массы печени и кишечника, а также длины кишечника по сравнению с контролем. Однако, в некоторых случаях применение антибиотиков снижало негативный эффект глифосата, что, по всей вероятности, связано с подавлением развития патогенных микроорганизмов, которые обладают устойчивостью к глифосатам.
При исследовании биохимических и гематологических показателей крови цыплят отмечен ряд отклонений, свидетельствующих о токсическом действии глифосата на организм птицы. В частности, на фоне глифосата детектировано увеличение ЩФ, АЛАТ и АСАТ а также снижение концентрации альбумина на протяжении роста птицы во всех опытных группах.
2 ЧАСТЬ ИСЛЕДОВАНИЙ направлена на разработку биопрепарата на основе штамма-деструктора глифосата
По результатам полногеномного секвенирования и биоинформатической обработки у штаммов B. mucilaginosus, B. subtilis, B. cereus, Ent. faecium был обнаружен целый комплекс потенциальных прогнозируемых пробиотических свойств. Штамм B. mucilaginosus потенциально способен к синтезу веществ с антимикробной активностью. У штаммов были выявлены широкие потенциальные возможности к метаболизму токсических соединений, включая глифосат. У штамма B. subtilis были выявлены гены maoA, ОН, HPAD, HPADO, feaB и ряд других, связанных с разложением ароматических аминов и других подобных соединений.
Все исследованные культуры штаммов-биодеструкторов глифосата обладали выраженной активностью в отношении ряда тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий. Штамм B. mucilaginosus проявил наиболее выраженную активность. Для дальнейшей работы планируется использовать штаммы B. mucilaginosus и B. subtilis, как обладающие наибольшим потенциалом.
Публикации
1. Йылдырим Э.А., Лаптев Г.Ю., Тюрина Д.Г., Горфункель Е.П., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Дубровин А.В., Бражник Е.А., Новикова Н.И., Меликиди В.Х., Калиткина К.А., Пономарева Е.С., Гриффин Д.К., Романов М.Н. Investigating adverse effects of chronic dietary exposure to herbicide glyphosate on zootechnical characteristics and clinical, biochemical and immunological blood parameters in broiler chickens Veterinary Research Communications, 2023. V.8 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s11259-023-10195-x
2. Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Тюрина Д.Г., Пономарева Е.С. Studying the expression of productivity and immunity genes of chickens under the influence of feed glyphosate using the RNA-seq method BIO Web of Conferences, 2023. V. 67, P. 02021 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1051/bioconf/20236702021
3. ЛАПТЕВ Г.Ю., ЙЫЛДЫРЫМ Е.А., НОВИКОВА Н.И., ТЮРИНА Д.Г., ИЛЬИНА Л.А., ДУБРОВИН А.В., ФИЛИППОВА В.А., КАЛИТКИНА К.А., ПОНОМАРЕВА Е.С., МЕЛИКИДИ В.Х., ГОРФУНКЕЛЬ Е.П., МОЛОТКОВ В.В., АХМАТЧИН Д.А. Раскрыть генетический потенциал: отрегулировать транскриптом Комбикорма, 2023, №2, С.65-67 (год публикации - 2023)
4. Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Тюрина Д.Г., Ильина Л.А,, Филиппова В.А., Калиткина К.А., Дубровин А.В., Новикова Н.И., Меликиди В.Х., Горфункель Е.П., Пономарева Е.С., Околелова Т.М., Грозина А.А., Громов Д.Н. Глифосат – опасный помощник в битве за урожай Птицеводство, 2023. №4. С. 27-32. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.33845/0033-3239-2023-72-4-27-32
5. Лаптев Г.Ю., Тюрина Д.Г., Йылдырым Е.А, Ильина Л.А., Горфункель Е.П., Филиппова В.А., Дубровин А.В., Меликиди В.Х., Новикова Н.И., Калиткина К.А., Молотков В.В.. Пономарева Е.С, Analysis of Changes in Broiler Microbiome Biodiversity Parameters Due to Intake of Glyphosate and Probiotic Bacillus Sp. Gl-8 Using Next-Generation Sequencing Smart Innovation, Systems and Technologies, 2023. V.362. P. 161–170 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/978-981-99-4165-0_15
6. Лаптев Г.Ю., Филиппова В.А., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Тюрина Д.Г., Горфункель Е.П., Дубровин А.В., Меликиди В.Х., Калиткина К.А., Ключникова И.А., Пономарева Е.С., Громов Д.А., Дже Жу Influence of Glyphosate Herbicide on the Functional State of the Poultry Intestine Microbiome Smart Innovation, Systems and Technologies, 2023. V.362. P. 151–160 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/978-981-99-4165-0_14
7. Тюрина Д.Г., Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Филиппова В.А., Калиткина К.А., Молотков В.В. Expression of Prostaglandin-Related Genes in Broilers Under the Influence of Glyphosate and Probiotic AIP Conference Proceedings, 2023, V. 2817, I.1, P.020077, 8 pp. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1063/5.0148368
8. Лаптев Г.Ю., Тюрина Д.Г., Йылдырым Е.А. Оценка экспрессии генов бройлеров, связанных с ростом и формированием мышечных волокон, под влиянием антибиотиков, глифосата и штамма микроорганизма Bacillus sp. Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 190-летию со дня рождения И.А. Стебута «Приоритеты развития АПК в условиях цифровизации и структурных изменений национальной экономики», С.113-114 (год публикации - 2023)