Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Изучение взаимодействий полисахаридов с биологически активными веществами является перспективным для решения задачи повышения устойчивости к деградации флавоноидов и фитоэкдистероидов в составе разработанных ранее функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ1 из листьев шпината и ФПИ2 из зерен киноа). Механическим методом были получены экспериментальные композиции биологически активных добавок (БАД) различного состава (всего 12 видов), включающие ФПИ1 и ФПИ2, полисахариды – инулин и гуаровую камедь. Далее была проведена оценка сорбционных свойств полисахаридного компонента и установлено, что наиболее полное формирование комплексов включения «полисахарид-минорное биологически активное вещество» характерно для 8 составов композиций, включающих инулин и гуаровую камедь. С использованием ферментативной модели in vitro была изучена способность 20Е высвобождаться из матрикса композиций БАД. Для 2-х составов композиций БАД с инулином было отмечено практически полное высвобождение 20Е. Для остальных композиций БАД, включающих инулин и гуаровую камедь отмечено неполное высвобождение 20Е с сорбцией выше 25%, данные композиции БАД были исключены из дальнейших исследований. Далее было проведено испытание стабильности БАД с инулином в стресс-условиях (температура, УФ-облучение) с целью изучения вынужденного процесса разложения (установления снижения концентрации БАВ). Установлено, что инулин способствует сохранению полифенольных соединений при действии высоких температур. После УФ-облучения уровень деградации полифенольных соединений был незначительным - 5-8%. В композициях БАД с инулином после экспозиции при повышенной температуре степень деградации 20 Е составила - 1,6%. После УФ-облучения уровень деградации 20Е составил 2-3 %. В результате установлено, что инулин способен повышать стабильность минорных биологически активных веществ – полифенольных соединений и 20Е. Для дальнейших исследований in vivo отобраны композиции БАД1 - содержание 20Е в сухом продукте составило 0,79±0,05 мг/г, общих полифенолов – 42,2±4,2 мг/г, инулина 92,95±9,3% и БАД2 - 20Е в сухом продукте составило 0,81±0,07 мг/г, общих полифенолов – 33,5±3,3 мг/г, инулина 97,30±9,7%. Проведена сравнительная верификация экспериментальных моделей стресса и физической нагрузки на 68 крысах-самцах линии Вистар. В нашем исследовании мы использовали 2 модификации тренировок в тестах «Беговая дорожка» и «Принудительное плавание»: 5 раз в неделю и 1 раз в неделю с последующей истощающей физической нагрузкой на последний день исследования. Общая продолжительность эксперимента составила 36 суток. Показано снижение у всех животных, подверженных физической нагрузке, уровня глюкозы крови, ввиду активного расхода АТФ за счет гликолиза. В крови животных, плавающих 5 дней в неделю, плавающих 1 день в неделю и животных, бегающих 1 день в неделю, отмечено достоверное увеличение уровня кортикостерона по сравнению с интактными животными контрольной группы. Накопление кортикостерона в крови животных свидетельствует об активации стресс-системы в ответ на физическую нагрузку. В крови животных, которые бегали 5 дней в неделю, не выявлено достоверного увеличения кортикостерона в крови, что говорит об адаптации организма животного во время регулярных нагрузок. У животных всех групп, подвергавшихся как принудительному плаванию в обоих режимах, так и беговой нагрузке, отмечено достоверное увеличение уровней дофамина, норадреналина и адреналина по сравнению с животными контрольной группы. При физических нагрузках и стрессовых ситуациях, сопровождающихся повышением возбудимости и эмоционального фона, активация компенсаторного механизма ускоренного синтеза катехоламинов, приводит к повышению уровней их экскреции через мочевыделительную систему. Тестирование на Беговой дорожке требует стадии ознакомления животных для снижения выраженности стресс-реакции, стадии обучения, на этапе которой происходит отбор животных в эксперимент (животных, не обучаемых бегу отбраковывают), далее идет стадия тренировок (необходимо сформировать навык) и завершающая истощающая нагрузка. Основные минусы: необходимо брать большие выборки животных с учетом отбраковки (20-25% животных не обучаются бегу), беговая дорожка оборудована электродами, которые являются отрицательным подкреплением, стимулирующим животное к бегу, и является фактором высокой травмоопасности. Мы показали, что при тренировках 5 раз в неделю животные хорошо адаптируются, травмоопасность минимальна, на стадии истощения животные демонстрируют большую выносливость по сравнению с животными, тренирующимися 1 раз в неделю. Вместе с тем, адаптация крыс к физической нагрузке способствует стабилизации уровней маркера стресса - кортикостерона. При тренировках 1 раз в неделю мы показали более выраженную реакцию стресс маркеров: кортикостерона и катехоламинов. Тест «Принудительное плавание» предпочтителен по ряду причин: крысы умеют хорошо плавать, соответственно их не нужно обучать; нет отсева животных, что позволяет использовать меньше крыс; методика не травмоопасна, плавание 1 раз в неделю с последующей истощающей нагрузкой позволяет моделировать необходимые условия стресса, и оценить физическую выносливость. Показано, что при обеих модификациях плавания 1 раз в неделю и 5 раз в неделю уровень кортикостерона крови животных и экскреция катехоламинов в моче животных были достоверно выше по сравнению с показателями для животных контрольной группы. В этой связи целесообразным является использование модели «Принудительное плавание» в наших дальнейших исследованиях по сравнительной физиолого-биохимической оценке эффективности адаптогенных и пребиотических свойств разработанных ранее ФПИ и новых БАД. Проведен эксперимент in vivo с использованием 50 крыс-самцов линии Вистар возрастом 6 недель в условиях профилактического введения в рацион животных разработанных ФПИ1, ФПИ2, БАД1 и БАД2. Проведена оценка их модулирующего действия на микробиоту кишечника. Простагландин Е2 является компонентом периферического отдела стресс-лимитирующей системы и относится к её ингибиторам, ограничивающим действие активаторов стресс-системы - катехоламинов и глюкокортикоидов, предупреждая стрессорные повреждения. Нами было показано, что потребление животными ФПИ1 и БАД1 на основе листьев шпината снижало в крови концентрацию активатора стресс-системы кортикостерона при одновременном увеличении в крови содержания ингибитора стресс-системы простогландина Е2. Потребление ФПИ2 и БАД2 на основе зерен киноа достоверно снижало только уровень кортикостерона крови по сравнению с интактными животными контрольной группы, не оказывая воздействия на периферический отдел стресс-системы. Полученный нами результат согласуется с гипотезой о прострессорной роли адаптогенов, способных оказывать влияние на синтез ингибиторов и активаторов стресс-системы, изменяя их содержание в крови, приводящее к активации адаптивных реакций со стороны гомеостатических систем, повышая, таким образом, общую резистентность организма. При введении в рацион животных БАД1 и БАД2 наблюдалось снижение уровней и частоты встречаемости Blautia spp, что является благоприятным изменением микробиоты. Уровень Blautia spp положительно коррелирует с метаболическими нарушениями при сердечно-сосудистых заболеваниях. Введение БАД2 приводило к снижению содержания Escherichia coli. Потребление БАД1 увеличивало содержание защитных F. Prausnitzii и снижало соотношение lg уровней B. fragilis group/F. prausnitzii, высокие значения которого являются потенциальным биомаркером дисбиоза провоспалительного типа. Введение в рацион животных ФПИ1 и ФПИ2 не оказывало влияния на микробиоту кишечника. Показанное нами благоприятное влияние разработанных БАД на микробиоту кишечника открывает дополнительный потенциал их использования для поддержания оптимального состава микробиоты кишечника.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В современном обществе растет востребованность потребления адаптогенов растительного происхождения, обеспечивающих оптимальный уровень метаболизма, снижение воздействия неблагоприятных факторов, таких как синдром хронической усталости, подверженность психоэмоциональному стрессу, повышенные физические и когнитивные нагрузки. Нами была разработана технология получения новых биологически активных добавок к пище - комплексов инулина с фитоэкдистероидами и полифенолами, из листьев шпината или зерен киноа. Проведена комплексная экспериментальная оценка соответствия физико-химических, органолептических, микробиологических и санитарно-химических показателей разработанных БАД. Разработаны проекты технической документации на новые БАД1 и БАД2: технические условия и технологические инструкции. В ходе выполнения работ в 2023 году были выработаны две партии функциональных пищевых ингредиентов: ФПИ1 (из листьев шпината) и ФПИ2 (из зерен киноа). На основе выработанных партий ФПИ1 и ФПИ2 были получены две партии новых БАД: БАД1 и БАД2. Было проведено определение содержания 20-гидроксиэкдизона и основных флавоноидов методом ВЭЖХ как в опытных партиях ФПИ1 и ФПИ2, так и в обоих вариантах биологически активных добавок в пище. Дополнительно в БАД определяли содержание инулина. Проведен эксперимент по сравнительной физиолого-биохимической оценке эффективности и влияния на микробиоту кишечника разработанных ранее ФПИ и новых БАД в условиях принудительного плавания. Исследование выполнено с использованием 60 крыс-самцов линии Вистар возрастом 7-8 недель с исходной массой тела 190±2г. Исследования на животных одобрены Этическим комитетом ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», выписка из протокола Заседания этического комитета №4 от 14.06.2022. В рацион животных дополнительно вносили ФПИ1 и ФПИ2, БАД1 и БАД2 (из расчета дозы 20Е 2мг/кг массы тела животного). Животных всех групп подвергали принудительному плаванию 1 раз в неделю еженедельно в течение 10 минут. На 30 сутки эксперимента животных подвергали истощающему плаванию. После этого животных немедленно помещали в обменные клетки для сбора суточной мочи. На следующие сутки крыс выводили из эксперимента; отбирали цельную кровь на антикоагулянт для проведения гематологического анализа, из остальной собранной крови получали сыворотку. В моче анализировали содержание катехоламинов, в сыворотке крови определяли показатели белкового, липидного, минерального обмена, показатели функционального состояния печени, содержание кортикостерона, простагландина Е2, адренокортикотропного гормона (АКТГ) и альдостерона. Микробиоту исследовали методом ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы «Колонофлор 16 Премиум». Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics 20 (IBM, США). Потребление животными ФПИ и БАД, оказывало благоприятное воздействие на набор массы тела животными. Введение в рацион животных БАД2 также способствовало нормализации аппетита у животных, снижение которого показано у крыс, на фоне стресса в условиях принудительного плавания. У животных, подвергавшихся принудительному плаванию один день в неделю, выявлено достоверное увеличение уровней АЛТ и АСТ, коэффициента де Ритиса и мочевой кислоты и достоверное снижение щелочной фосфатазы сыворотки крови по сравнению с интактными животными. Потребление животными ФПИ1 и ФПИ2, а также БАД1 и БАД2 приводило к нормализации некоторых биохимических показателей до уровня контрольных животных. У животных, подверженных стрессорному воздействию в тесте принудительное плавание, выявлено достоверное увеличение средней концентрации гемоглобина в эритроците, показана тенденция к увеличению среднего объема эритроцитов, гематокрита, абсолютной ширины распределения эритроцитов по объему; снижению числа тромбоцитов при одновременном увеличении их среднего объема. Потребление животными ФПИ и БАД на фоне стрессорного воздействия нормализовало все вышеперечисленные показатели до уровня контрольных интактных животных. Различий между группами животных в уровнях АКТГ и гормонов коры надпочечников - кортикостерона и альдостерона в сыворотке крови выявлено не было. При этом был выявлен достоверный (p<0,05) рост ингибитора стресса - простагландина Е2 в крови животных групп, получавших ФПИ и БАД. У животных, получавших ФПИ1 и ФПИ2, а также БАД1, выявлено достоверное увеличение уровня норадреналина по сравнению с контрольной группой. Физическая нагрузка в виде плавания не приводила к изменению уровней защитных популяций микробиоты, наблюдалось только достоверное снижение частоты выявления Enterobacter spp. и метаногенных архей Methanosphaera stadtmanae по сравнению с контрольной группой. Добавление ФПИ1 к рациону животных не оказывало влияния на уровни изучаемых популяций микробиоты кишечника, при этом добавление ФПИ2 приводило к увеличению содержания Roseburia inulinivorans (продуценты бутирата), Blautia spp. и Ruminococcus spp. (продуценты ацетата). Добавление к рациону изучаемых БАД1 и БАД2 не оказывало бифидогенного эффекта, но приводило к другим изменениям микробиоты: увеличение содержания Faecalibacterium prausnitzii (продуцент бутирата), снижение содержания Bacteroides spp. и соотношения Bacteroides spp./F. prausnitzii, свидетельствующее об улучшении анаэробного баланса микробиоты. Также наблюдалось увеличение содержания Prevotella spp. (продуцент ацетата), повышение частоты выявления архей M. stadtmanae, снижение общего содержания бактерий Streptococcus spp. Простагландин Е2 относится к ингибиторам стресса, которые ограничивают действие его активаторов: катехоламинов и глюкокортикоидов, предупреждая стрессорные повреждения. Нами было показано, что потребление животными ФПИ1 на основе листьев шпината, ФПИ2 и БАД2 на основе зерен киноа, приводило к увеличению в крови содержания ингибитора стресс-системы простагландина Е2. При физических нагрузках и стрессовых ситуациях запускается механизм активного синтеза катехоламинов, которые выводятся из организма мочевыделительной системой. Показанное в нашем исследовании накопление в моче животных, получавших БАД и ФПИ, норадреналина свидетельствует об активации защитного механизма синтеза катехоламинов. Потребление животными ФПИ1 и ФПИ2, а также БАД1 и БАД2 приводило к нормализации некоторых биохимических показателей до уровня контрольных животных: к снижению уровня мочевой кислоты и повышению содержания щелочной фосфатазы, фосфора и кальция. Потребление животными ФПИ и БАД на фоне стрессорного воздействия нормализовало гематологические показатели крови животных до уровня контрольной группы. Растворимые пищевые волокна, к которым относится инулин, как известно, являются субстратом для ферментации в толстой кишке преимущественно анаэробными микроорганизмами, в процессе чего вырабатываются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), играющие важнейшую роль в поддержании здоровья и гомеостаза кишечника. Наиболее значимыми КЦЖК являются уксусная, пропионовая и масляная кислоты (ацетат, пропионат и бутират). Большой массив накопленных данных свидетельствует о том, что увеличение концентрации КЦЖК оказывает благоприятное воздействие на организм человека, снижая риски развития ожирения и сахарного диабета. Введение в рацион животных БАД1, БАД2 и ФПИ2 приводило к улучшению анаэробного баланса и увеличению уровней защитной популяции микроорганизмов, продуцентов КЦЖК (масляной и уксусной кислот). Соответственно в нашем эксперименте показано положительное влияние БАД1 и БАД2, а также ФПИ2 (из зерна киноа) на состав микробиоты кишечника. Полученные результаты убедительно свидетельствует о перспективности широкого использования новых БАД и специализированных пищевых продуктов на их основе для питания различных групп людей, в том числе, чья профессиональная деятельность связана с особыми нагрузками, с вредными условиями труда и/или проживающих и работающих в неблагоприятных климатических условиях. Все запланированные на 2023 г. работы по Проекту выполнены в полном объеме.