Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Флуоресцеин проявляет свойства фотокислоты в физиологическом диапазоне рН (5÷8), что обусловлено переходом электронно-возбужденной анионной формы этого красителя в дианионную форму посредством переноса протона к растворителю (pKa 6,68). Исследования первого этапа реализации проекта были направлены на выяснение вопроса, является ли данная реакция переноса протона в возбужденном состоянии диффузионно контролируемым процессом. Для этого была изучена зависимость спектрально-люминесцентных свойств флуоресцеина от двух основных факторов, влияющих на скорость диффузии молекул в растворе – вязкости и температуры среды. Были изучены спектры поглощения и испускания флуоресценции флуоресцеина в растворах с варьируемой вязкостью (1-3 сП) и температурой (10-80 С) при трех значениях рН (6, 6.5, 12). Измеряли спектры флуоресценции на двух длинах волн возбуждения – 488 и 435 нм, соответствующих преимущественному поглощению дианионной и анионной форм красителя соответственно. В качестве аналитического ратиометрического сигнала, чувствительного к смещению ионного равновесия и не зависящего от концентрации красителя и геометрии возбуждения, использовали отношение интегральных сигналов флуоресценции, полученных при двух длинах волн возбуждения. Вязкость растворов варьировали путём добавления разных концентраций сорастворителей (этиленгликоль, глицерин, глюкоза, сахароза). Вариацию температуры проводили с помощью темостатированной ячейки приборов. Предварительное исследование влияния концентрации фосфат ионов (акцепторов протонов) в составе фосфатного буфера на ратиометрический сигнал флуоресцеина показало, что оптимальной концентрацией для наблюдения эффектов, связанных с фотопереносом протона, является 1 М. Эта концентрация была использована во всех дальнейших экспериментах. Было получено, что ратиометрический сигнал флуоресцеина в вязких средах проявляет зависимость от типа сорастворителя. По амплитуде изменения ратиометрического сигнала при pH 6,5 с ростом вязкости от 1 до 3 сП использованные сорастворители располагаются в следующий ряд: сахароза=глюкоза < глицерин < этиленгликоль. Вязкие среды с сахаридами не оказывали эффекта на ратиометрический сигнал, в то время как в растворах полиолей зависимость от вязкости имела вид кривой с насыщением (максимальное увеличение – на 80% в случае этиленгликоля). Измерение квантового выхода другого флуоресцентного зонда – молекулярного ротора 9-(2-карбокси-2-циановинил)юлолидина (CCVJ) в тех же условиях показало, что его сигнал зависит линейно от вязкости раствора в исследованном диапазоне и не определяется химической природой сорастворителя. Таким образом, был сделан вывод о том, что в отличие от CCVJ, флуоресцеин не может быть использован в качестве универсального зонда на микровязкость, однако его ратиометрический сигнал флуоресценции может быть информативен в отношении специфического взаимовоздействия с вязким сорастворителем, приводящего к нарушению диффузионного контроля реакции переноса протона. Была выявлена линейная связь ратиометрического флуоресцентного сигнала флуоресцеина с температурой среды в диапазоне 10-80С, которая воспроизводится и в цикле охлаждения. Было установлено, что угол наклона зависимости (чувствительность на 1 С) составляет: 0,0027 (pH 6,5) и 0,0042 (pH 6,0). Контрольный эксперимент, выполненный для монораствора дианиона флуоресцеина при рН 12, показал отсутствие зависимости от температуры. На основе этих результатов сделано предположение, что температурозависимый ратиометрический сигнал флуоресцеина при физиологических значениях pH может быть использован в аналитических целях для определения температуры в гомогенных растворах (с фиксированным значением pH и концентрации фосфат ионов). Для оценки эффективности переноса протона, зависящей от температуры и концентрации протонакцепторных добавок (молярности фосфатного буфера), была создана кинетическая модель фотопроцессов, реализованная в виде программы ЭВМ (Св-во 2022669602 от 21.10.2022). По результатам исследований в 2022 году опубликованы 3 статьи (одна из них в входит в базу данных Scopus) и сделано три доклада на конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведен сравнительный анализ спектрально-люминесцентных характеристик флуоресцеина в растворах при рН 6,50 в свободном состоянии и ковалентно-связанного с белком флуоресцеина-5-изотиацианата (FITC) с белками разного размера: лизоцимом белка куриных яиц (Lys, 14,3 кДа), карбоксиангидразой Б быка (BCA, 29 кДа), бычьим сывороточным альбумином (BSA, 67 кДа) и бактериальной люциферазой (Luc, 79 кДа). Выявлено различия между спектрами поглощения флуоресцеина в свободном и связанном состояниях, а также между характеристиками зонда, связанного с разными белками, на основе чего сделан вывод о смещении дианион-анионного равновесия флуоресцеина в приповерхностных областях белков по сравнению с таковым в объемном растворителе. По спектрам поглощения были рассчитаны фактические концентрации ионных форм и вычислены локальные значения рНlocal для белков: 7,05 для FITC-Lys, 6,25 для FITC-BCA, 6,35 для FITC-BSA и 6,01 для FITC-Luc. Был сделан вывод о том, что эффекты, оказываемые белками на сигнал флуоресцентного зонда, обусловлены электростатическими свойствами их поверхности: при рН 6,50 положительно заряженный Lys отталкивает протоны буфера, а отрицательно заряженные BCA, BSA и Luc – притягивают. В контрольных экспериментах установлено отсутствие влияния тех же белков, но без ковалентного связывания, на спектральные характеристики флуоресцеина в буфере с рН 6,50. Методами молекулярного моделирования установлено образование стабильных водородных связей атомов кислорода гидроксильной (О1) и карбонильной (О3) групп ксантенового кольца флуоресцеина с молекулами воды, как для флуоресцеина в свободном состоянии, так и для красителя, связанного с белками. Присутствие глицерина и сахарозы не изменяет заселённость водородных связей О1 (центра протонирования) и О3 с водой, хотя молекулы сорастворителей способны приближаться к О1 и О3 на достаточное расстояние и образовывать нестабильные связи, чаще всего одновременно с молекулами воды. Состояние гидратной оболочки флуоресцеина оценили по профилю функции распределения минимального расстояния (MDDF) для воды относительно поверхности красителя. Анализ выявил разное соотношение пиков первого и второго гидратного слоя (при 1,8 и 2,7 А соответственно) для моноанионной и дианионной форм флуоресцеина в свободном состоянии, а также снижение присутствия воды в гидратной оболочке FITC, связанного с белками, по сравнению с зондом в свободном состоянии, что наиболее сильно выражено для FITC-Lys. Исследована температурная зависимость ратиометрического pH-чувствительного сигнала флуоресцеина I488/I435 и получено, что в диапазоне 10-80 oС в буферном растворе pH 6,00 и 6,50 I488/I435(Т) носит линейный характер. Сочетанием экспериментальных и расчетных методов проведена оценка эффективности и направления влияния на величину углового коэффициента зависимости I488/I435(T) следующих механизмов: I. изменение ионного равновесия в основном состоянии; II. изменение ионного равновесия в возбужденном состоянии; III. изменение вероятности поглощения при длинах волн возбуждения 488 и 435 нм; IV. изменение квантового выхода флуоресценции. Установлено, что наибольшее влияние на температурную чувствительность I488/I435 оказывает механизм I: (константа равновесия смещается на 0,25 в сторону дианионов), а учет механизмов I-III позволяет получить зависимость, близкую к экспериментально наблюдаемой. Выявлено, что линейная зависимость I488/I435(T) сохраняется и в вязких средах (в буферных растворах с добавлением вязких агентов). Определены механизмы, обеспечивающие различающееся влияние растворов глицерина и сахарозы на угловой коэффициент I488/I435(T) флуоресцеина. В целом, установлено, что чувствительность ратиометрического сигнала к концентрации вязких агентов имеет опосредованный характер, напрямую не связанный с вязкостью раствора. Получена линейная корреляция температурной чувствительности ратиометрического сигнала с изменением молярной энтальпии реакции депротонирования флуоресцеина в присутствии вязких агентов.