Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Основные работы первого года выполнения проекта направлены на исследование взаимодействия хитозана (CS) с L-(D-)энантиомерами аспарагиновой (AspA) и (L-(D-)диастереомерами аскорбиновой кислот (AscA), используемых в качестве донора протона при формировании изомерных солевых комплексов полимер−кислота (растворы, порошки, гидрогели). Образование солей, их состав и отличительные особенности доказаны методами элементного анализа, потенциометрического титрования, ИК-Фурье и ЯМР-спектроскопии. Исследованы также структурные характеристики (XRD, SAXS, АСМ), стереоспецифические особенности (ПМ, СЭМ, ТЭМ), хирооптические (КД, ДОВ) и общебиологические свойства полученных солевых форм L- и D-аспарагината, L- и D-аскорбата хитозана. 1. Установлено, что взаимодействие CS с L-(D-)AsрA или L-(D-)AscA в водной среде протекает с переносом протона кислоты на аминогруппу полимера с образованием энантио- и диастереомерных солевых комплексов между макромолекулами протонированного хитозана и аспарагинат или аскорбат-анионами. В отличие от описанных в литературе водорастворимых солевых форм CS с анионами карбоновых кислот L- и D-аспарагинат (аскорбат) CS характеризуется высокой степенью кристалличности и развитой системой меж- и внутримолекулярных водородных связей. Более высокоупорядоченной структурной обладают D-изоформы хиральных солей CS. 2. Индикатрисы SAXS тонких гидрогелевых пластин показали фрактальную организацию наноразмерных фазовых неоднородностей в пространственной сетке гидрогеля с наибольшим средним размером рассеивающих агрегатов для образца D-солевой формы CS. Функции объемного распределения рассеивающих доменов по размерам имеют бимодальный характер с большей амплитудой и более узким распределением основной фракции наноструктур для D-образцов. Анализ АСМ-изображений выявил существенное влияние изоформы хирального кислотного остатка на морфологию и профиль поверхности гидрогелей. Использование для формирования солевой формы полимера L-изомеров кислот повышает масштаб шероховатости и уменьшает пористость гидрогелевой поверхности, в случае D-изомеров реализуется антибатная закономерность. 3. Охарактеризованы хирооптические свойства растворов и обнаружены различия в пространственной конфигурации макромолекул полученных полисолей. Водные растворы CS с L- и D-аспарагинат- или L- и D-аскорбат-анионом в УФ-области характеризуются эффектом Коттона, также наблюдающего для водных растворов изомеров индивидуальных кислот (L-(D-)AsрA, L-(D-)AсA), но не выявляющегося в водных растворах низкомолекулярного CS. Сделан вывод, что эффект Коттона проявляется вследствие формирования аминоаспарагинатного или аминоаскорбатного хромофора, является результатом возбуждении С=С–связи и соответствует π→π* переходу. При этом, энантио-обогащенные соли CS·L-(D-)AsрA характеризуются разными по знаку (+/–) и близкими по модулю значениями молярной эллиптичности ([θ]), а также одинаковой длиной волны максимума дихроичной полосы (λ). Диастерео-обогащенные соли CS·L-(D-)AsсA показывают положительный эффект Коттона, близкие значения [θ] и значимо дифференцируются по λ. В видимой области спектра оптическая активность образцов описывается нормальной дисперсией и различается направлением вращения плоскости поляризации (правым/левым) и модулем удельного оптического вращения. 4. Стереоизомерия кислотного остатка отражается и на надмолекулярном упорядочении твердой фазы L- и D-солевых комплексов CS. ТЭМ-фотографии L-аскорбата хитозана показывают, что его конденсированная фаза представлена разветвленной дендритной структурой с плотными симметричными нитевидными ветвями шириной ~0.2–0.4 мкм и углом между их осями ~60–70 град. Геометрия дендритной структуры D-аскорбата хитозана менее разветвленная и менее регулярная. Ширина основных ветвей и угол между их осями увеличиваются до ~0.5–1.2 мкм и ~80–90 град, соответственно. Кроме того, морфоструктура дендрита более рыхлая, а количество боковых ответвлений значимо меньше в сравнении с образцом, полученным с использованием L-изомера AscA. Различие в надмолекулярной организации твердой фазы обнаруживается и методом СЭМ для лиофильно высушенных порошков. Методом ПМ обнаружено, что при высаживании CS·L-AscA спиртовым раствором L-ментола формируются преимущественно анизодиаметрические фибриллярные образования, проявляющие в поляризованном свете ярко выраженную оптическую анизотропию, CS·D-AscA – плотно упакованные конфокальные домены близкой к сферической формы. Исследование кинетики экстракционной кристаллизации L-ментола в водных растворах CS∙L-(D-)AspA показало влияние стереоизомера AspA на скорость фазового разделения хиральной модельной системы и размер формирующихся фазовых агрегатов: более крупные частицы агрегированных кристаллов L-ментола образуются в среде CS∙D-AspA. 5. Экотоксикологические исследования по результатам 2 биотестов (S. quadricauda, Daphnia magna) показали, что препараты полисолей не являются токсичными. Наиболее интенсивный рост клеток зеленых водорослей и наибольшая выживаемость планктонных ракообразных происходит в среде CS∙D-AsрА и CS∙D-AsсА. Минимальная концентрация, не оказывающая токсическое действие на тестируемые организмы, выше для D-изоформы полимерного хирального вещества, в случае изомеров индивидуальных кислот – L-антипода. 6. Микробиологическое исследование in vitro выявило различие в характере воздействия хиральных полисолей хитозана на прокариотические клетки (референтные штаммы бактерий S. aureus 209 P и E. coli 113-13) в зависимости от их хирооптических характеристик. Экспериментально установлено, что соли CS с D-AspA или D-AsсA проявляют более высокую антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных патогенных и условно-патогенных бактерий. В случае индивидуальных кислот AsрA или AscA, как и следовало ожидать, биоцидная активность L-изомеров выше по сравнению с D-изомерами в отношении обеих тестируемых культур. Обнаружено также, что CS·D-AscA вызывает более глубокие деструктивные изменения в морфологии клеток бактерий S.aureus и E.coli (от формирования удлиненных клеток с видимыми признаками нарушения клеточного деления до скопления агглютинированных мелких клеток и деструкции клеточной стенки), чем CS·L-AscA. Таким образом, проведенные исследования на двух типах хиральных систем – энантиомерных и диастереомерных хитозансодержащих препаратах – подтверждают нашу гипотезу, что принципам биологической гомохиральной иерархии наиболее соответствуют производные хитозана (D-аминоглюкана) с D-антиподом кислоты. Полученные результаты составят надежную базу для выполнения исследования по оценки ассиметричного влияния хирального лиганда на структуру, конформацию, физико-химические свойства и биологическую функциональность L- и D-антиподов аспарагината (аскорбата) хитозана, запланированного на 2023 год. По материалам выполнения проекта (со ссылкой на поддержку РНФ) в 2022 году опубликована статья в журнале, индексируемом в WOS и Scopus, еще одна рукопись находится в печати (2023 г., №1, Scopus). Результаты выполнения проекта руководитель и исполнители представляли на 5 конференциях, из которых 3 – международные, 1 – с международным участием, 1 – школа-конференция молодых ученых. Работа на 3-х конференциях проходила в очном формате. Все запланированные результаты получены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Основные работы второго года выполнения проекта направлены на исследование конформационных особенностей макромолекул и построенных из них хиральных надмолекулярных структур, сорбционно-диффузионных свойств и биологической функциональности донорно-акцепторных систем на основе солевых комплексов хитозана (CS) с L-(D-)энантиомерами аспарагиновой (AspA) и L-(D-)диастереомерами аскорбиновой кислот (AscA). 1. Установлено, что хиральные соли CS∙L-AspA и CS∙D-AspA в водной среде проявляют свойства полиэлектролита с частично скомпенсированным зарядом, когда часть противоионов кислотного остатка ассоциирована с макрокатионом. Конформационная лабильность макроцепей сопровождается объединением ионных пар в мультиплетные структуры и фазовой сегрегацией полимерного вещества на уровне наночастиц (для исследуемых объектов обнаружено впервые), элементный состав которых соответствует солевой форме полимера. Наиболее интенсивное протекание ассоциативных процессов реализуется в D-солевых комплексах полимер‒кислота, что приводит к формированию наночастиц с меньшим эффективным диаметром в сравнении с L-солями. Модификация поверхности нанокомплексов защитной оболочкой (например, сеткой …≡Si−O−Si≡... связей) позволит в будущих исследованиях найти пути к разработке нового способа препаративного получения биологически активных хиральных хитозансодержащих наночастиц. 2. Впервые обнаружено, что высаживание этанольного раствора L-ментола в водном растворе CS∙L-(D-)AspA протекает по механизму экстракционной кристаллизации и сочетает два типа фазового разделения: жидкость−жидкость на начальном этапе с образованием прямой микроэмульсии «масло в воде» и жидкость−кристалл на конечном с формированием неполосчатых сферолитов. Скорость обоих типов разделения фаз, размер капель «масляной» фазы и анизотропных кристаллических частиц зависит от изомера AcpA и существенно выше при фазообразовании в среде D-аспарагината CS. Кроме того, в растворе CS∙L-AspА кристаллиты дисперсной фазы практически не агрегируют, образуя лишь дендритоподобные образования из неполосчатых сферолитов и первичных структурных элементов – нитевидных вискеров, а в среде CS∙D-AspА возможна коалесценция вискеров в уплотненную конденсированную фазу. 3. В тонких пленках CS∙L-(D-)AsсA имеет место анизотропия оптической активности и удельное оптическое вращение [α] зависит от угла ориентации образца относительно направления вектора поляризации падающего пучка света в плоскости, перпендикулярной этому пучку. Для обработки угловых зависимостей (индикатрис) применён алгоритм с выделением постоянного члена (изотропной фазы CS) и четырех гармоник (анизотропные подсистемы [α]i, ряд Фурье), определяемых элементами структуры с соответствующей симметрией: структурами неправильной формы ([α]1), стержневидными в плоскости пленки ([α]2), спиральными, расположенными перпендикулярно поверхности пленки ([α]3), и кристаллическими структурами ([α]4). Сопоставлением гармонических составляющих [α]i с осесимметричными элементами оценен вклад в оптическую активность хиральных солей CS отдельных надмолекулярных структур, охарактеризованных в 2022 г. прямыми структурными методами. Для пленок CS∙L-AscA наибольшую амплитуду имеет [α]4, вслед за ней по уменьшению интенсивности идёт [α]2 и [α]3, для пленок CS∙D-AscA доминируют [α]4 и [α]2, затем по уменьшению идет [α]1. При этом, интенсивность гармоник для пленок CS∙L-AscA существенно выше по сравнению с пленками CS∙D-AscA. 4. Анализ физико-химических параметров сорбции паров воды показал более высокие значения начальной скорости сорбции и сорбционной емкости монослоя, пропорциональной содержанию активных центров сорбции, для порошков CS∙L-AscA, что (как и результаты п. 2) свидетельствует о более плотной структуре солевых комплексов CS∙D-AscA. Изотермы сорбции хиральных солей S-образны и удовлетворительно аппроксимируются термическим уравнением сорбции и суперпозицией изотерм Лэнгмюра и Флори–Хаггинса. Значения константы адсорбционного равновесия, численно равной отношению констант сорбции и десорбции, а, следовательно, характеризующей энергию взаимодействия полимер–сорбат, для L-аскорбатов CS выше, чем для D-аскорбатов. Аналогичный характер выявляется и для характеристической энергии сорбции порошков CS∙L-AscA и CS∙D-AscA. Абсолютные значения свободной энергии смешения и, соответственно, обусловленное взаимодействием полярных групп термодинамическое сродство компонентов и устойчивость системы хиральная соль + вода увеличиваются в ряду CS∙D-AscА → CS∙L-AscА. Это можно объяснить тем, что взаимодействие CS (D-глюкана) с D-AscA энергетически и стерически более выгодно чем с L-AscA. Кроме того, сильные взаимодействия между хиральным CS и D-диастереомером AscА, обеспечивающие надлежайшее стерическое соответствие компонентов солевого комплекса, сохраняются и в набухшей системе, что мешает молекулам воды всесторонне гидратировать и полимер и D-лиганд («поверхностная» гидратация). 5. Фитотестирование диастереомерных и энантиомерных солевых комплексов CS путем внесения в почвогрунт или полива растворами на примере 3-х тестируемых растений (лен Linum usitatissimum, редис Raphanus sativus, горчица Sinapis alba) выявило их высокую ростостимулирующую активность, в том числе в условиях этиолирования (рост всходов тест-растений в темноте). Во всех экспериментах наилучшие фитостимулирующие эффекты (увеличение количества всходов семян тест-растений в модифицированном почвогрунте, усиление роста и вегетации тест-растений при поливе растворами испытуемых препаратов) наблюдались для D-изомерных солей. 6. Стереоизомерия кислотного остатка отражается и на гемосовместимости in vitro L- и D-изоформ аспарагината CS. Наиболее высокое значение минимально допустимой концентрации, не вызывающей гемолиза эритроцитов, наблюдается для D-солевых комплексов при эквимольном и меньшем соотношении полимер‒кислота. 7. Биотестирование in vitro на примере человеческих кератиноцитов, фибробластов и эпителиоцитов МА-104 показало, что добавка в питательную среду для культивирования клеточных культур хиральных солей CS не только положительно влияет на скорость адгезии и распластывания клеток, но и ускоряет их пролиферацию. Обнаруженные особенности позволяют рассматривать L-(D-)аскорбаты и L-(D-)аспарагинаты CS в качестве перспективной модифицирующей добавки для улучшения ростовых качеств питательной среды и ускорения роста популяции эпителиальных и эпителиоподных клеточных культур. Во всех случаях наиболее эффективная адгезионная и пролиферативную активность тестируемых клеток наблюдалась для D-солевых комплексов хитозан‒кислота. Таким образом, исследования второго года выполнения проекта подтверждают нашу гипотезу, что принципам биологической гомохиральной иерархии наиболее соответствуют производные хитозана (D-аминоглюкана) с D-антиподом кислоты. По материалам выполнения проекта (со ссылкой на поддержку РНФ) в 2023 году опубликовано 6 научных работ, включая 4 статьи в журналах из баз данных WOS и Scopus. Две рукописи приняты к печати в «International Journal of Biological Macromolecules» (Q1, IF = 8.2) и «Журнал физической химии» (Q4). Результаты выполнения проекта руководитель и исполнители представляли на 7 конференциях, из которых 5 – международные, 2 – всероссийские. Работа на 5-ти конференциях проходила в очном формате. Всего сделано 8 докладов, включая приглашенный пленарный, 2 устных, 3 стендовых и 2 онлайн-презентации. Все запланированные результаты получены в полном объеме.