Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения проекта изучалась роль крупных рек как географических барьеров в генетической дифференциации сусликов Евразии на примере двух политипических широкоареальных видов – краснощекого (Spermophilus erythrogenys) и малого (S. pygmaeus) сусликов. В восточной части ареала комплекса краснощеких сусликов водным барьером является река Обь. Исследование полноразмерного гена cyt b мтДНК обнаружило значительный уровень генетической дифференциации (p-дистанция 6,4%; net-дистанция 6,2%) между популяциями сусликов, обитающих на левом и правом берегах Оби. Значения всех показателей генетической изменчивости гена cyt b в 2–4 раза выше у сусликов, обитающих на левом берегу Оби. Для геномного анализа использовались 24 образца: 13 экз. из 7 локалитетов на левом берегу Оби, и 11 экз. из 2 локалитетов на правом. Анализ популяционно-генетической структуры сусликов разных берегов Оби проведен по массиву данных из 260 SNP. UPGMA-дендрограмма и анализ главных компонент (PCA) разделили выборку на две клады, соответствующие берегам Оби. Первоначальный анализ в STRUCTURE также выявил два кластера. Дальнейший иерархический анализ показал подразделение левобережного кластера еще на две группы – равнинные популяции и предгорные. Среднее значение Fst между сусликами разных берегов составило 0,49, что соответствует их значительной дифференциации и практически полному отсутствию потока генов. При подсчете попарных значений Fst между отдельными популяциями наименьший уровень дифференциации обнаружен между равнинными популяциями левого берега (0,07–0,15) и между двумя правобережными популяциями (0,10). Показатели генетического разнообразия по SNP-маркерам выше у левобережных краснощеких сусликов по сравнению с правобережными. Таким образом, анализ митохондриального (cyt b) и ядерных (SNP) маркеров дал сходные результаты, подтвердив роль реки Обь как эффективного географического барьера для изоляции и генетической дифференциации S. erythrogenys. Полученные данные позволяют утверждать, что на правом берегу Оби обитает не номинативный подвид краснощекого суслика, а отдельная не описанная форма вероятно видового ранга. Протяженный ареал малого суслика разделен тремя крупными реками – Дон, Волга, Урал. Выборка составила 67 образцов тканей сусликов из 20 поселений, расположенных во всех междуречьях крупных рек. Западная часть ареала: междуречье Днепр–Дон - 8 экз. из 3-х локалитетов, Дон–Волга - 21 экз. из 6-ти локалитетов, горный малый суслик S. p. musicus – 3 экз. из 1-го локалитета. Восточная часть ареала: междуречье Волга–Урал - 17 экз. из 4-х локалитетов, к востоку от реки Урал - 18 экз. из 6-ти локалитетов. ML-анализ митохондриального гена cyt b подтвердил разделение гаплотипов малого суслика на западную (правый берег р. Волги) и восточную (левый берег р. Волги) клады с дистанцией 4,9%. Гаплотипы горного малого суслика оказались внутри западной клады. Суслики с правого и левого берегов р. Дон не образуют отдельных филогрупп в составе западной клады. В восточной части ареала в отдельную субкладу выделяются только суслики левого берега р. Урал. Сеть гаплотипов показала сходные с ML-деревом результаты. Показатели генетической изменчивости в западной группе выше, чем в восточной, за исключением S. p. musicus, для которого характерны ее минимальные значения. Высокий уровень Fst выявлен между популяциями сусликов с разных берегов Волги, а максимальные значения изоляции характерны для S. p. musicus. Популяционно-генетический анализ проводили по 352 SNP. UPGMA-дендрограмма оказалась в целом сходной с митохондриальным ML-деревом, однако отличалась положением малого горного суслика. Если в ML-дереве S. p. musicus располагался внутри западной клады, то в SNP-анализе занимал в ней базальное положение. Деление общей выборки на три генетических кластера – горные суслики, западные и восточные по отношению к Волге малые суслики – поддержано программой STRUCTURE и PCA-анализом. Средний уровень дифференциации (Fst) между популяциями западной и восточной частей ареала составил 0,31. Наиболее дифференцированным оказался S. p. musicus (0,41 при сравнении с западными и 0,59 с восточными малыми сусликами). Для изучения барьерной роли других крупных рек – Дона в западной части ареала и Урала в восточной – дальнейший анализ проводился отдельно для каждой части ареала. После повторного генотипирования выборок количество выявленных SNP составило в западной части ареала 463, в восточной – 552. В восточной части ареала STRUCTURE показала оптимальное деление выборки на четыре кластера. Два кластера соответствуют популяциям междуречья Волга–Урал и два территории к востоку от р. Урал. По уровню Fst средняя дифференциация (0,14–0,17) выявлена между географически близкими, не разделенными р. Урал, кластерами. Сильно изолированными (0,35–0,36) оказались популяции малых сусликов Казахского мелкосопочника. Полученные данные указывают на барьерную роль р. Урал, а также позволяют говорить о вероятном влиянии палеореки, протекавшей по тургайской котловине во время плейстоценовых оледенений, на изоляцию крайних восточных популяций. В западной части ареала выявлена более сложная генетическая структура. Здесь также обнаружено четыре генетических кластера, однако их географическая структурированность выражена слабо и не зависит от речных барьеров. Популяции, расположенные в северной части правобережного ареала, состояли из генетически сходных экземпляров. Южные популяции (Приазовье, Нижняя Волга и Предкавказье) были генетически разнообразными и содержали, в основном, «смешанные» экземпляры. При попарном сравнении кластеров наиболее изолированными оказались суслики Предкавказья (Fst 0,14–0,32), в остальных парах сравнения генетическая изоляция была слабой (0,04–0,11). Показатели генетического разнообразия малых сусликов уменьшались в западной части ареала с юга на север, в восточной – с запада на восток. Таким образом, геномный анализ показал: 1) малые суслики дифференцируются на два кластера – западный и восточный, границей между которыми является русло Волги; 2) западная часть ареала малого суслика характеризуется, в основном, широтной генетической структурированностью, не зависящей от речного барьера (р. Дон); 3) для восточной части ареала характерна долготная структурированность, с выраженным влиянием рек (Урал и, вероятно, Палео-Тургай) на генетическую дифференциацию; 4) данные генетической изменчивости являются аргументом в пользу гипотезы формирования S. pygmaeus в долговременном Предкавказском рефугиуме и среднеплейстоценового возраста горного малого суслика S. p. musicus. Сходные результаты анализов данных таргетного секвенирования мтДНК и высокопроизводительного секвенирования с неполным покрытием яДНК свидетельствуют о перспективности данного подхода при изучении вопросов внутри- и межвидовой дифференциации видов сусликов и таксономического статуса спорных форм.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Впервые методом ddRad-seq оценивалось влияние крупных рек на генетическую дифференциацию широкоареального вида – крапчатого суслика (Spermophilus suslicus). Этот вид является единственным среди палеарктических сусликов, у которого обнаружен диморфизм числа хромосом. Различают две хромосомные формы, признаваемые рядом авторов в качестве самостоятельных видов (Загороднюк, Федорченко, 1995; Брандлер и др., 2015), которые разделены рекой Днепр: 2N=36 для S. odessanus (к западу от Днепра) и 2N=34 для S. suslicus s. str. (к востоку от Днепра). Всего изучено 53 образца S. suslicus из 19 локалитетов расположенных на территории Молдавии, Украины и России. Западная по отношению к реке Днепр форма представлена 21 экземплярами из 7 локалитетов, восточная форма – 32 экз. из 12 локалитетов. Кроме крапчатых сусликов для сравнения генетической дифференциации в выборку были включены следующие виды рода Spermophilus: S. citellus, S. taurensis, S. major, S. fulvus, S. pygmaeus, в качестве внешней группы Urocitellus undulatus и Marmota sibirica. Всего в анализе использовано 92 образца восьми видов наземных беличьих. После подготовки библиотек и секвенирования на геномном анализаторе Illumina HiSeq 2500 (1 дорожка, 125 циклов PE) получено 258,0 миллионов чтений, из которых 253,3 млн. (98,2 %) прошли сортировку по штрих-коду и фильтрацию по качеству. Филогенетический анализ конкатенированных SNPs данных (56 132 SNP) 92 экземпляров проводился с использованием алгоритма максимального правдоподобия (ML). Результаты анализа показали поддержанную монофилию рода Spermophilus и четкую филогенетическую структуру, включающую шесть поддержанных основных генетических линий, соответствующих валидным видам рода. Филогенетическая реконструкция согласуется с ранее известными хромосомными данными и результатами, полученными по маркерам митохондриальной ДНК. Подтверждено разделение крапчатого суслика на две обособленные клады – западную и восточную с дистанцией соответствующей видовому уровню. ML-анализ показал филогеографическое деление внутри западной и восточной клад, обусловленное влиянием рек Буга и Дона. В западной кладе выделяются две субклады включающие популяции, обитающие в междуречьях Прут–Буг и Буг–Днепр. В восточной кладе влияние реки Дон выраженно слабее и субклады междуречий Днепр–Дон и Дон–Волга менее поддержаны. Среднее значение Fst между S. suslicus разных берегов Днепра составило 0.27, что подтверждает их значительную дифференциацию. Кроме того, по данным анализа 24 633 SNPs были выявлены пять гибридов S. suslicus x S. citellus, происходящих из двух популяций европейского суслика расположенных в центральной Молдавии и имеющих в геноме примеси аллелей крапчатого суслика на уровне 44–8%%. Таким образом, методом ddRAD-seq подтверждена барьерная роль крупных рек, в первую очередь Днепра, для дифференциации крапчатых сусликов. Анализ SNPs позволил установить надежную филогению для шести видов Spermophilus и показал, что в составе S. suslicus sensu lato можно выделить два отдельных вида, а именно S. odessanus, обитающий в западной части ареала и S. suslicus, населяющий восточную часть ареала. Отметим, что данные ddRAD-seq указывают на разделение малых сусликов S. pygmaeus sensu lato на две формы видового ранга обитающие на разных берегах реки Волги, подтверждая результаты полученные нами ранее методом MIG-seq.