Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчётном периоде были выполнены все запланированные работы. Были спроектированы гибридные белки, составленные из основы – Sm-подобного белка из Sulfolobus acidocoldarius (SacSm) и апикального домена шаперона GroEL из Escherichia coli (AD). Два спроектированных варианта отличаются порядком доменов в полипептидной цепи и длинной линкера (AD-SacSm и SacSm-AD). Генетические конструкции, кодирующие эти белки, были получены. Целевые белки были синтезированы с использованием прокариотической системы экспрессии. Схема выделения белков была разработана и по ней очищены необходимые количества белков. Таким же образом были получены контрольные белки SacSm и AD. Для освоения методов исследования процесса сворачивания гомоолигомерных кольцевых белков и уточнения деталей самоорганизации Sm-подобных белков в сотрудничестве с группой экспериментальных исследований и инженерии олигомерных структур ИБ РАН была выполнена работа по исследованию влияния мутаций на третичную и четвертичную структуру Sm-подобного белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa. Спроектированные и полученные нами гибридные белки были исследованы различными методами для установления их структурных характеристик. Методом кругового дихроизма показано, что все белки приобретают ожидаемую вторичную структуру. Устойчивость AD к действию мочевины и повышению температуры при включении в гибрид практически не изменилась. Но при этом белок даже после денатурации апикального домена сохраняет олигомерную структуру за счёт более стабильного SacSm и не склонен к агрегации при нагреве. После денатурации мочевиной белок способен к сворачиванию обратно в нативную форму. Была проверена функциональная активность полученных белков. Методом поверхностного плазмонного резонанса показано, что белок основы SacSm сохраняет свою функцию связывания специфичных РНК и в составе гибридного олигомера. AD в мономерной форме не обладает выраженной шаперонной активностью, но будучи включённым в гибридные белки, олигомеризуется и такую активность проявляет. Связывание ненативных белков нашими гибридами показывает, что как минимум в ряде случаев для этого процесса не требуется внутренняя полость как в полноразмерном GroEL. Проверка шаперонной активности полученных белков показала, что их добавление предотвращает образование крупных агрегатов таких белков как IgG и лизоцим при нагреве. Полученные данные позволяют продолжить выполнение данного проекта и в соответствии с планом работ перейти к получению трансмембранного белка стабилизированного SacSm.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году были продолжены работы по изучению шаперонной активности полученного в первый год выполнения проекта шаперона AD-SacSm. Для ответа на вопрос: «сколько доменов AD достаточно для прочного связывания ненативного белка?» была разработана методика получения гетероолигомера AD-SacSm/SacSm сразличным количеством AD. Был получен ряд гетероолигомеров с количеством AD от 1 до 7. Для оценки стехиометрии комплексов, образующихся при связывании ненативных белков гетероолигомерными вариантами шаперона AD-SacSm/SacSm и силы связывания между белками в них был разработан метод, основаный на металл хелатной хроматографии и количественном анализе её результатов гельэлектрофорезом в денатурирующих условиях. Совокупность полученных данных позволяет предположить следующую картину: взаимодействие одиночного апикального домена с ненативными белками достаточно слабо. Это не позволяет его детектировать нашим методом. При близком расположении нескольких AD на единой основе ненативный белок может взаимодействовать с несколькими доменами одновременно и, соответственно, стабильность такого комплекса экспоненциально возрастает. Наш модельный белок альфалактальбумин небольшой и не может взаимодействовать с более чем двумя AD что проявляется отсутствием изменения константы диссоциации при увеличении доли AD-SacSm в гетероолигомере. В то же время его малый размер позволяет разместить до 4х молекул на полном гептамерном кольце AD-SacSm. В 2023 году мы продолжили эксперименты по поиску и оптимизации условий кристаллизации исследуемых белков. Более крупные кристаллы были получены в условии 33 набора ProPlexII с добавлением ксилитола в качестве добавки, а также в условии 44 набора Nuc-Pro. Однако размер полученных кристаллов всё еще недостаточен для получения дифракционных данных высокого разрешения. Спроектированы гибридные белки из трансмембранного фрагмента белка CelIII (TMCelIII) и белка SacSm. Получены соответствующие генетические конструкции. Для наработки целевых белков опробованы несколько вариантов клеточных и бесклеточных систем. Белки были получены и очищены в денатурирующих условиях с последующей частичной ренатурацией. Для структурной характеризации были получены спектры КД в дальней УФ области для белков как отдельно, так и в присутствии фосфолипидных везикул. Показано, что значимые изменения структуры белка при взаимодействии с везикулами происходят при рН 5.0 и ниже. Во всех условиях белок имеет хорошо выраженный спектр КД характерный для бета структурных белков. Качественный тест на способность вызывать проницаемость мембран белками TMCelIII-SacSm и SacSm-TMCelIII показали, что они способны образовывать поры и вызывать выход флуоресцеина из везикул. Для количественного определения параметров связывания CELIII-SacSm с фосфолипидной мембраной был применён метод поверхностного плазмонного резонанса. Результаты измерений показывают, что гибридный белок эффективно связывается с везикулами и удерживает их на поверхности чипа. Дальнейшие исследования этим методом позволят определить зависимость процесса связывания от таких условий как рН, ионная сила, фосфолипидный состав мембраны.