Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На данном этапе работы проведено исследование влияния фосфорилгуанидинового остатка в праймерной цепи на эффективность Taq ДНК-полимеразы проводили на модельной системе, представленной 30-звенной матрицей М30 и 20-звенными модифицированными удлиняемыми праймерами Р* (более 35 вариантов), содержащими фосфорилгуанидиновые остатки в разных участках сайта связывания праймера с комплементарной матрицей и за его пределами. Показано, что максимальный выход продукта наблюдается с участием нативного праймера Р0, а также с модификациями P3/5, Ph2/5, P1-7, P1-9, P1-10, P1-11. А минимальный выход продукта наблюдается с участием модифицированных праймеров P3/3, P2/5, P1-2, P1-3, P1-4, P1-5. Полученные результаты были сведены в общую матрицу и обработаны в программе STATISTICA 10 (Statsoft). Получена достоверная корреляция между экспериментальными и расчетными данными. Предсказано влияние модификации на эффективность выхода полноразмерного продукта удлинения: введение модификаций на 3ʹ-конец праймера снижает эффективность его элонгации, при этом наибольшее влияние оказывает введение модификации в первый с 3ʹ-конца фосфат. Неожиданным оказалось также негативное влияние модификаций на 5ʹ-конце удлиняемого праймера. А вот введение модификаций в положения с 7 по 13 с 5ʹ-конца приводит к увеличению выхода продукта реакции удлинения. Синтез флуоресцентно-меченных ФГО происходит с меньшими выходами по сравнению с нативным олигонуклеотидом, но даже в случае полностью модифицированной 26-звенной последовательности выход в результате автоматического синтеза превышает 50%. Полученные олигонуклеотиды способны к хроматографическому разделению в индивидуальном виде с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила. Показано, что при введении ФГ-модификаций в состав олигонуклеотида наблюдается тушение флуоресценции, которое пропорционально количеству ФГ-модификаций в составе олигонуклеотида. При сравнении флуоресценции олигонуклеотидов, несущих флуоресцентную метку на 5’- конце, в непосредственной близости от ФГ модификации и на удалении, наблюдается незначительное тушение флуоресценции (около 20%) при введении модификации в любое из рассмотренных положений. При сравнении флуоресценции олигонуклеотидов, несущих флуоресцентную метку в середине последовательности, тушение флуоресценции не наблюдалось. Перспективы использования модифицированных праймеров для аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) были оценены по двум параметрам: 1) оценка специфичности, значение ΔCq = CqWT − Cq1%; 2) эффективность ПЦР, при низкой эффективности ПЦР низкий уровень мутации определить будет затруднительно. Эффективность ПЦР праймеров меняется от 67% до 107,2%. Считается оптимальной эффективность ПЦР от 90%. Однако ФГ-модифицированные праймеры частично ингибируют ПЦР. В рамках данной системы ФГ-праймеры не позволяют достичь нужной эффективности. Считаем наиболее перспективным для дальнейших исследований выбрать праймеры с эффективностью ПЦР более 80%. Специфичность выявления мутации оценивали по параметру ΔCq = CqWT − Cq1%, то есть по разнице количества циклов для ПЦР ДНК дикого типа и 1% мутантной ДНК на фоне ДНК дикого типа. Для нативных праймеров эти значение не превышают 1 цикла. При введении ФГ-модификации специфичность возрастает. Праймеры с низкой эффективность ПЦР менее 80% и специфичностью менее ~ 1 цикла будут исключены из дальнейших исследований на 2 году проекта. При исследовании влияния ФГ-модификации на эффективность разгорания сигнала зонда и его работоспособности для АС-ПЦР показано, что более 5 модификаций равномерно распределенных по зонду или на 5’ практически не позволяют получить какой-либо флуоресцентный сигнал, то есть Taq ДНК-полимераза не способна гидролизовать такие зонды. Три ФГ-модификации понижают эффективность ПЦР, что выражалось как в снижении разгорания, так и в увеличении Cq. Эффект 3 модификаций зависит от их положения: 3 подряд на 5’-конце эквивалентны 3 равномерно распределённым, но ингибируют ПЦР сильнее, чем 3 подряд на 3’-конце. Лучше всего разгорание происходит в случае нативного зонда, в меньшей степени с 3 модификациями на 3’-конце зонда. Зонды с 3 модификациями на 5’-конце или распределенные по зонду существенно снижают флуоресцентный сигнал. Для исследования фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов в качестве зондов для гетерофазного гибридизационного анализа были разработаны подходы иммобилизации ФГО на различные поверхности: стеклянные и золотые слайды, кремниевая поверхность КНИ-биосенсора, магнитные наночастицы оксида железа и композитный материал из оксида железа и полимера нейлон-6. При оценке эффективности гибридизации комплементарных НК с иммобилизованными ФГО-зондами показано, что использование незаряженных зондов позволяет формировать гибридизационные комплексы между зондом и РНК-маркером с одинаковой эффективность независимо от солевых условий, что существенно расширяет возможности метода, например, позволяет уменьшить структурированность РНК-матрицы, используя буферные растворы с низкой ионной силой или в условиях полного отсутствия электролитов. В качестве носителя, обладающего магнитными свойствами для удобства манипуляций и повышенной емкостью по отношению к иммобилизуемым олигонуклеотидам, был разработан композитный материал на основе нейлона-6 и наночастиц оксида железа MNP@Ny6 [Bulgakova et. al. Magnetochemistry. 2022]. Наличие полимера нейлона-6 в составе композита позволяло использовать упрощенный подход к иммобилизации олигонуклеотидов под действием УФ-облучения по методике ранее разработанной авторами проекта [Дмитриенко и др. Биорганическая химия. 2010]. Ёмкость MNP@Ny6 по иммобилизованному ДНК-зонду составила 2,2 ± 0,2 нмоль/мг. В качестве гетерофазной системы для пробоподготовки нуклеиновых кислот разработан протокол гибиридизации иммобилизованных на композитный MNP@Ny6 материал олигонуклеотидных зондов с мишенью в растворе с последующим извлечением мишени в индивидуальном виде [Bulgakova et. al. Magnetochemistry. 2022]. Таким образом на данном этапе работы разработаны подходы к иммобилизации ФГО-зондов на разные типы поверхности. Показано, что использование фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидных зондов увеличивает эффективность гетерофазной гибридизации нуклеотидных маркеров в низкосолевых условиях (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4) и в бессолевых условиях. Апробированы протоколы пробоподготовки аналита с использованием композитного материала на основе магнитных наночастиц оксида железа и полимера нейлона-6. Использование биосенсоров без меток и амплификации, таких как КНИ-транзисторы, позволяет упростить и облегчить процедуру детекции нуклеиновых кислот. При разработке системы выявления маркерных последовательностей нуклеиновых кислот с помощью КНИ-транзистора следует учитывать высокую чувствительность сенсорной поверхности, которая откликается на любое возникновение/изменение заряда. Такие параметры раствора как ионная сила, pH и диэлектрическая проницаемость влияют на состояние транзистора. В рамках данной части работы исследовано влияние параметров среды, таких как ионная сила, рН и диэлектрическая проницаемость раствора, на сток-затворные характеристики микропроволочных КНИ транзисторов, содержащих на поверхности различные группы. Показано что модификация поверхности КНИ транзисторов, ионная сила, рН и диэлектрическая проницаемость среды, в которую они помещены, влияют на сток-затворные характеристики. Определены критерии выбора условий среды для детекции заряженных биомолекул: I) значение рН буферного раствора должно быть таким, чтобы поверхность не несла значительного заряда; II) ионная сила раствора должна быть минимальной.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения первого блока работ по проекту в 2023 году проведено детальное исследование влияния количества и положения ФГ-модификаций в составе праймеров на эффективность протекания реакции удлинения цепи с помощью Taq ДНК-полимеразы. На основании расчетных параметров набор модифицированных олигонуклеотидов был дополнен последовательностями, содержащими единичные и множественные модификации в центре и на 5’-конце последовательности 20-звенного олигонуклеотида. Все синтезированные олигонуклеотиды были исследованы, как в качестве праймеров при ферментативном удлинении в составе дуплексов с комплементарной 30-звенной матрицей М30, так и в качестве матриц в составе дуплексов с комплементарной 8-звенной последовательностью флуоресцентно-меченного олигонуклеотида Z8 с помощью Taq-ДНК-полимеразы. Для ФГ-модифицированных олигонуклеотидов, которые дают максимальный и минимальный выход продукта, как в случае праймера, так и в случае матрицы, показана возможность их применения в качестве праймеров для амплификации гена eGFP в режиме реального времени с использованием нативного обратного праймера. Показано, что часть модифицированных праймеров не только не ингибируют ПЦР, но и обеспечивают значения Ct ниже, чем для нативного праймера. Однако праймеры, которые эффективно удлинялись в процессе исследования на модельной системе Р20/М30, но ингибировали ферментативное удлинение в качестве матрицы (система Z8/Р20), демонстрировали снижение эффективности ПЦР в реальном времени. С учетом полученных данных осуществлён дизайн и синтез набора модифицированных праймеров, содержащих все возможные варианты ближайших соседей и мисматчей непосредственно рядом с введением фосфорилгуанидиновой модификации, для систематического исследования выявления однонуклеотидных полиморфизмов в процессе аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Показано, что некоторые пары праймеров ингибируют ПЦР в случае наличия мисматча, и при этом наличие ФГ-модификации приводит к еще большему ингибированию, чем в его отсутствии. Проанализирован пул полученных продуктов ПЦР методом высокопроизводительного секвенирования. В случае использования библиотеки праймеров без мисматча в 3’-положении, наличие ФГ-модификации полностью ингибирует образование несовершенных продуктов. Таким образом показано, что включение ФГ-модификации в праймеры для ПЦР приводит к усилению различия между ДНК дикого типа и мутированной ДНК, обеспечивая высокую дискриминирующую способность праймеров в аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени (АС-ПЦР). Далее мы использовали ФГ-модификацию для улучшения специфичности праймеров с неблагоприятным несоответствием 3'-конца праймера Pyr/Pur в комплексе матрица/праймер. Для подтверждения преимуществ ФГ-модификации были выбраны две мутации гена PIK3CA (E542K, E545K). Для каждой мутации синтезировали несколько праймеров с ФГ-модификациями и оценивали их эффективность и дискриминирующую способность с помощью АС-ПЦР с контрольными плазмидами и ДНК, полученной из тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE). Анализ позволяет обнаружить 0,5% мутированной ДНК на фоне матрицы ДНК дикого типа с хорошей специфичностью, при этом наибольшая специфичность для ФГ-модифицированных праймеров приходится на третий межнуклеотидный фосфат с 3'-конца. По сравнению с ddPCR праймеры с ФГ-модификацией продемонстрировали 100% специфичность и 100% чувствительность к ДНК из FFPE с наличием мутаций выше 0,5%. Подробное исследование специфичности праймеров с ФГ-модификацией проводили на образцах плазмидной ДНК с различным процентом мутаций. Полученные результаты указывают на высокий потенциал ФГ-модифицированных праймеров для обнаружения точечных мутаций. Основной принцип разработанной методики можно использовать для повышения специфичности праймеров независимо от последовательностей. С учетом накопленных данных ФГ-модификация может стать универсальным инструментом повышения специфичности и селективности праймеров. Вторая часть работ посвящена исследованию применения фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидных зондов для КНИ-биосенсора и оптимизации условий проведения анализа с учетом особенностей сенсора. Проведено исследование влияния совокупности параметров раствора и размеров кремниевых транзисторов на сток-затворные характеристики КНИ-биосенсора. В рамках работы было исследовано влияние параметров растворов на отклик сенсора, а именно: значения рН, ионной силы и диэлектрической проницаемости раствора, для чипов, содержащих немодифицированные кремниевые проволоки шириной 0,2 и 3 мкм. Кроме того, было проанализировано влияние модификации поверхности микропроволочных транзисторов при помощи GOPTS и APTES. Показано, что измерения сток-затворных характеристик проволок шириной 3 мкм достаточно воспроизводимы на всем чипе на воздухе и в деионизированной воде. Для проволок шириной 0,2 мкм наблюдалась достаточная корреляция результатов между разными проволоками одного и того же чипа при измерениях на воздухе. Для диапазона рН от 3 до 12 обнаружены значительные изменения сток-затворных характеристик, которые выходят на плато при значениях рН 7 и выше. Высокая чувствительность к pH (около 1500 и 970 мВ/pH) наблюдалась на проволоках шириной 3 мкм и 0,2 мкм в диапазоне значений pH от 3 до 7. Показано более высокое соотношение тока «включения» к току «выключения» для более широких микропроволок. При всех изученных значениях pH I вкл. /I выкл. составляли до 4600 и 30800 для проволок диаметром 0,2 и 3 мкм соответственно. В схеме измерения тока сток-исток при фиксированных напряжениях на затворе наибольшая чувствительность к изменению pH достигнута при напряжении на затворе 13 и 19 В для датчиков 0,2 и 3 мкм соответственно. Показано что транзисторы шириной 0,2 мкм обладают воспроизводимыми сток-затворными характеристиками только при проведении измерений на воздухе или в строго регламентированных заранее подобранных условиях; транзисторы шириной 3 мкм как с немодифицированной, так и с модифицированной APTES или GOPTS поверхностью чипов, обладают более воспроизводимыми сток-затворными характеристиками при проведении измерений на воздухе и в различных растворах. С учетом полученных результатов все дальнейшие исследования с использованием КНИ-биосенсоров и модифицированных олигонуклеотидов проводили на микропроволоках шириной 3 мкм. В ходе выполнения проекта разработана система гетерофазного гибридизационного анализа на КНИ-биосенсоре, на поверхность которого были иммобилизованы НК- или ФГ-зонды, а также содержащего контрольные проволоки. Продемонстрирована специфичность анализа на разработанном КНИ-биосенсоре. Показано, что использование карбонилдиимидазола (CDI) в качестве активирующего агента позволяет с большей чувствительностью выявлять матрицу в сравнении с активирующим агентом 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом (GOPTS). При этом выявление протяженной рРНК матрицы оказалось более эффективным по сравнению с короткой синтетической ДНК-матрицей. Показано, что использование иммобилизованных ФГ-зондов позволяет проводить гибридизационный анализ с большей чувствительностью, чем с нативными олигонуклеотидными зондами. Таким образом, для проведения гетерофазного гибридизационного анализа на КНИ-биосенсоре были подобраны оптимальные условия: модификация сенсорной поверхности активирующим агентом CDI, использование ФГО в качестве иммобилизованных зондов и проведение анализа с протяженной структурированной рРНК. Продемонстрирована чувствительность КНИ-биосенсора на аттомолярном уровне с возможностью выявления рРНК-матрицы в концентрации 10-17 М.