Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью проекта является исследование разнообразия ксилобионтных грибов и бактерий в естественных условиях многовидового широколиственного леса на участках массового ветровала, который произошел в 2006 г. в заповеднике «Калужские засеки». В отчетный период по проекту проделана следующая работа. Для метагеномного анализа отобрано 150 образцов древесины восьми видов деревьев на пяти стадиях разложения. Образцы отобраны для 7 видов лиственных деревьев - клен остролистный (Acer platanoides), береза повислая (Betula pendula), ясень обыкновенный (Fraxinus excelsior), осина европейская (Populus tremula), дуб черешчатый (Quercus robur), липа мелколистная (Tilia cordata) и вяз шершавый (Ulmus glabra), а также одного хвойного вида дерева ель европейская (Picea abies). Оптимизирован протокол выделения суммарной ДНК и амплификации вариабельных участков ITS грибов. Из отобранных образцов древесины выделены суммарная ДНК бактерий и грибов. Более половины образцов подготовлены для последующего секвенирования. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей в общедоступной международной базе данных NCBI Nucleotide. Установлено, что для 12 из 175 видов (6.9%) афиллофороидных грибов, выявленных в районе проведения исследований ранее, отсутствуют какие-либо сведения о нуклеотидных последовательностях ITS1–5.8S–ITS2 области рДНК. Дополнительно составлен перечень из 11 таксонов, представленных в базе данных NCBI Nucleotide по одной и двум целевым нуклеотидным последовательностям. Проведен ДНК-баркодинг образцов плодовых тел ксилобионтных афиллофороидных грибов, собранных на валежных стволах восьми видов деревьев в местах отбора образцов древесины для метагеномного анализа. Получены 50 нуклеотидных последовательностей ITS1–5.8S–ITS2 области рДНК. Обеспечена сохранность образцов выделенной геномной ДНК в условиях морозильной камеры, определяющая возможность амплификации дополнительных участков генома. Создана библиотека из 50 референсных последовательностей ДНК макромицетов, подготовленных к депонированию в международную базу данных NCBI GenBank. Для каждой нуклеотидной последовательности приведена информация о методе выделения ДНК, использованных праймерах, а также подробные сведения о ваучерном гербарном образце. На основе секвенирования пилотных образцов были выявлены сообщества бактерий и грибов, содержащие представителей с известной способностью к разложению древесины. В процессе разложения древесины наблюдался выраженный рост разнообразия бактериального сообщества, при этом росло как число наблюдаемых бактериальных групп, так и возрастал индекс Шеннона (не возникало отдельных доминантных групп). Уменьшалось относительное количество представителей семейства Acidobacteriaceae и класса Bacili и росло количество представителей классов Actinobacteria и Thermoleophilia. В грибном сообществе прослеживалась смена доминирования представителей отдела Ascomycota на первой стадии разложения на представителей Basidiomycota на третьей стадии. Сообщество грибов выглядело менее разнообразным, чем сообщество бактерий; в ходе разложения древесины разнообразие сообщества грибов существенно снижалось, индекс Шеннона уменьшался (возникали доминантные группы в сообществе). Проанализированы физические и химические свойства древесины 8 видов деревьев на 5 стадиях разложения. Дисперсионный анализ показал, что виды деревьев наиболее ярко различались по содержанию и массовой концентрации Mn, Zn, Mg, Ca и K. Лидерами по содержанию этих элементов были: Mn – клен, береза, ель, липа; Zn – береза и осина; Mg – клен, вяз; Ca – вяз; K – липа, вяз. Стадии разложения древесины оказались значимым фактором вариации для содержания Mn, P, Cu, Zn и Ca. В ходе деструкции древесины стволов происходило существенное увеличение содержания указанных элементов. Сделан вывод, что поддержание циклов биофильных элементов успешнее реализуется при наличии валежа разных видов на разных стадиях разложения. Результаты исследования доложены в устных докладах на 6 научных конференциях. Опубликованы 4 статьи в научных изданиях. Одна из статей принята к печати в журнале Лесоведение, реферируемом в базе данных SCOPUS (выйдет в 2023 г.). Разработаны русско- и англоязычные страницы в Интернете по проекту; они расположены по адресам: https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/22-24-01063/index https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/22-24-01063/index&lang=eng

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Во второй год выполнения проекта в международную базу данных GenBank депонирована информация о 20 новых нуклеотидных последовательностях грибов, плодовые тела которых собраны непосредственно в местообитаниях, где проведен отбор проб для метагеномного анализа. Впервые полученные и депонированные в NCBI GenBank полные нуклеотидные последовательности ITS1-5.8S-ITS2 ярДНК представлены преимущественно таксонами, о которых отсутствует информация в референсных базах данных. В частности, впервые получены сведения о первичной структуре ITS области ярДНК для кортициоидных грибов из родов Peniophorella (Hymenochaetales), Hyphoderma, Phlebia (Polyporales), Amylocorticium (Amylocorticiales). Кроме того, получены нуклеотидные последовательности из аутентичных образцов для малоизвестных и редко обнаруживаемых в природе представителей родов ксилотрофных базидиомицетов Athelia (Atheliales), Leucogyrophana (Boletales), Kneiffiella (Hymenochaetales), Yuchengia (Polyporales). В международном репозитории GBIF опубликована информация по 146 находкам грибов на участках массового ветровала в смешанном широколиственном лесу. Из метагеномов валежных стволов всего было получено 4717 различных вариантов последовательностей ITS1 грибов и 92262 вариантов последовательностей регионов V4 гена 16S rRNA бактерий. После даунсэмплирования в сообществе грибов осталось около 2500, а в сообществе бактерий около 22500 уникальных последовательностей (при этом только 643 и 665 из них, соответственно, составляли один и более процентов от всех ASV сообществ хотя бы в одном образце). У всех рассмотренных видов деревьев наблюдалось увеличение альфа-разнообразия грибного и бактериального сообществ между начальными и конечными стадиями разложения, на всех стадиях разложения бактериальное сообщество было более разнообразно, чем грибное. На первых стадиях грибное сообщество состояло в среднем из примерно 25 видов с ярко выраженными доминантными представителями. Исключение составляла ель, на которой было найдено более 60 видов. Бактериальное сообщество каждого древесного вида состояло из более 200 видов, кроме клёна и берёзы, у которых наблюдалось 45 и 86 видов соответственно. К четвертой и пятой стадии разложения у всех видов деревьев в среднем наблюдалось более 100 видов грибов и от примерно 400 до более 600 видов бактерий. У некоторых видов деревьев наблюдался спад разнообразия исследуемых деструкторов на второй или третьей стадии разложения. При общей высокой зашумленности данных концентрация ампликонов от бактериальных сообществ на последней стадии разложения чаще была выше, чем на первой, тогда как у грибного сообщества часто наблюдался пик на более ранних стадиях (1-3) и спад на последней. По нашим данным, максимальная концентрация ампликонов от грибов и бактерий была характерна для липы, а минимальная - для дуба. В древесине дуба бактерии в заметном количестве появлялись только к третьей стадии разложения, что, вероятно, коррелирует с его устойчивостью к разложению (которая была нами показана ранее) и, как следствие, активным использованием в хозяйстве. Интересно, что в некоторых случаях - например, на первой стадии разложения у ясеня и второй у ели - грибы значительно превалировали над бактериями, что может быть связано с выделением ими бактерицидных веществ, а с переходом к более поздним стадиям разложения количество бактерий росло. Сообщество грибов характеризовалось очень высоким бета-разнообразием (среднее расстояние Брея-Кёртиса 0.96 ± 0.08), при этом расстояние между образцами разных древесных видов одной стадии разложения оказалось немного меньше, чем расстояние между образцами одного вида, но разных стадий, в результате чего наблюдалась более выраженная кластеризация образцов по стадии разложения, чем по виду дерева. В ходе разложения древесины грибное сообщество для некоторых древесных видов резко изменялось, демонстрируя смену доминантных представителей на уровне филума. Из 47 найденных классов в грибном сообществе 13 наблюдались хотя бы в одном образце каждой породы и каждой стадии разложения. В то же время большинство родов грибов наблюдалось только на образцах одного вида одной стадии, что говорит об отсутствии одного общего пути разложения древесины сообществом грибов. В бактериальном сообществе 13 из 104 классов и 146 из 781 родов наблюдались в образцах всех типов, при этом, как и в сообществе грибов, в частые классы входили доминантные представители. При оценке бета-разнообразия с помощью расстояния Брея-Кёртиса на уровне ASV бактериальные сообщества также сильно различались между образцами. По сходству сообществ бактерий (как и грибов, но для бактерий в большей степени) образцы кластеризовались более по стадиям, чем по древесным видам. По учету плодовых тел афиллофороидных грибов, на валежных стволах 8 видов деревьев было выявлено 127 видов базидиальных грибов, принадлежащих к 78 родам, 50 семействам, 14 порядкам. Максимальное видовое богатство отмечено на валежных стволах ели (46 видов). На древесине клёна зарегистрировано 38, на ясене – 24, на осине – 22 видов базидиомицетов; на валежных стволах остальных древесных видов - менее 20 (для каждой породы). Грибы белой гнили доминировали (74%), грибы бурой гнили составляли 19%; среди морфологических групп доминировали кортициоидные грибы и трутовики (55 и 32%, соответственно). Среднее число видов составило 1.8 ± 0.06 (SE) на метровой площадке и 10.4 ± 0.98 на ствол. Высокое гамма-разнообразие обеспечивалось высоким бета-разнообразием грибного сообщества: среднее расстояние по Брею-Кертису было 0.95 ± 0.001 и 0.92 ± 0.006 для площадок и стволов, соответственно. Стволы разных видов деревьев значимо не отличались по числу видов грибов, найденных на них, но отличались группы видов деревьев: по критерию Краскела-Уоллиса (χ2 = 9.48, P = 0.009) на видах лиственных деревьев с кольцесосудистой древесиной (дуб, ясень, вяз) было найдено значимо меньше грибов (в среднем на ствол 10.6 ± 1.2), чем на ели (16.8 ± 2.6). Состав базидиомицетов на стволах валежин разных видов деревьев достаточно хорошо различался, что показали результаты неметрического многомерного шкалирования (NMDS) и пермутационного многомерного анализа вариации (PERMANOVA). Видовая принадлежность стволов деревьев определяла 45% вариации видового состава базидиомицетов (P = 0.0001); вместе со средней стадией разложения ствола (R2 = 5%, P = 0.05), dbh и числом ненулевых площадок модель определяла 58% варьирования видового состава грибов. Аддитивное разбиение биоразнообразия показало, что вклады всех составляющих разнообразия являлись значимыми, но максимальный вклад (81%) в общее гамма-разнообразие базидиомицетов вносило композиционное разнообразие между видами деревьев, которое было статистически значимо выше, чем ожидаемое при нулевой модели. Таким образом, в целом мы получили соответствующие друг другу оценки разнообразия сообществ грибов, выявленных по плодовым телам и результатам метагеномного анализа. Два вида анализа показали увеличение разнообразия сообществ с увеличением стадии разложения и важность вклада разнообразия древесного субстрата в общее гамма-разнообразие грибного населения анализируемого участка. Метагеномный анализ позволил детально оценить количественное и качественное изменение видового разнообразия сообществ деструкторов (бактерий и грибов) в ходе разложения древесины различных видов деревьев; предположить специфические особенности изменения разнообразия в процессе разложения для каждого из восьми анализируемых древесных видов. Результаты исследования представлены на 4-х научных конференциях. Опубликовано 9 научных статей, среди них одна в журнале Q1 (IF 4.384); одна в журнале, регистрируемом в базе данных Scopus. Опубликовано также 4 статьи в сборниках материалов конференций и 2 набора данных. Обновлены двуязычные страницы проекта в сети Интернет https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/22-24-01063/index и https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/22-24-01063/index&lang=eng