КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 22-24-01124

НазваниеРазработка и внедрение методов пробоподготовки растительных объектов для серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM)

РуководительКотеева Нурия Каюмовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2022 - 2023 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-102 - Ботаника

Ключевые словаанатомия растений, ультраструктура, новые методы, трехмерная реконструкция, С3 и С4 фотосинтез, адаптациогенез, эволюция, биоразнообразие

Код ГРНТИ34.05.17


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Знание пространственной организации клеток и тканей необходимо для понимания функционирования, становления биоразнообразия и эволюции живых организмов. В настоящее время идет интенсивная разработка методов структурной ботаники, способствующих переводу анатомического описания растительных объектов на 3D уровень. Среди появившихся в последние десятилетия технологий объемной визуализации наиболее перспективным признается метод на основе серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM). Она позволяет получать реконструкции довольно крупных образцов (до 1 мм3) с высоким разрешением. Однако прогресс в данном направлении сдерживается из-за отсутствия корректных методов пробоподготовки для растительных объектов. Данный проект направлен на разработку и внедрение методов подготовки растительных тканей для SBF-SEM и их оптимизацию для наиболее сложных объектов, таких как злаки и суккуленты. Изучение функционирования и эволюции разных типов фотосинтеза чрезвычайно актуально в настоящее время в связи с поиском возможностей повышения продуктивности сельскохозяйственных растений. Одной из задач проекта является апробация методики пространственной реконструкции тканей листа и мембранных структур органелл у представителей с разным типом фотосинтеза для выявления базового комплекса структурных и функциональных параметров, связанных с увеличением фотосинтетической фиксации углерода и минимизацией потери воды при транспирации. Впервые будет изучена специфика трехмерного распределения органелл в клетках ассимилирующей паренхимы С4 видов в зависимости от уровня экспрессии основных и дополнительных декарбоксилирующих ферментов, что позволит оценить функциональное значение структурной и биохимической вариабельности близкородственных видов. Полученные данные позволят расширить наши представления о возможных путях становления структурного и биохимического разнообразия С4 пути метаболизма, приближая нас к пониманию того, как они эволюционируют в тесной взаимосвязи с условиями среды, а также как они регулируются и формируются. Перевод базовых анатомических описаний на 3D уровень крайне важны как для пополнения фундаментальных знаний в области биологии, так и для прикладных разработок. Важным направлением исследования при внедрении методов 3D визуализации будет оптимизация измерений количественных параметров тканей и клеток, которые рассчитываются на единицу объема. Внедрение нового современного метода позволит сделать новый качественный шаг в исследовании путей эволюции фотосинтеза в разных группах цветковых растений. Преимуществом заявляемого проекта является комбинация современных методов анатомии, физиологии и биохимии растений с новейшими подходами в микроскопии. Решение задач, заявленных в проекте, позволит внедрить новый современный метод исследования, крайне необходимый для дальнейшего прогресса в разных областях ботаники.

Ожидаемые результаты
1. Будут разработаны протоколы пробоподготовки для серийной блочной сканирующей электронной микроскопии, оптимальные для разных типов растительных объектов (злаки и суккуленты с разными типами фотосинтеза) с учетом конечных целей (тканевой и ультраструктурный уровень). Будет подготовлена методологическая статья. 2. На основе применения нового метода объёмной реконструкции планируется выявить особенности трехмерного распределения ассимиляционной паренхимы, проводящей ткани и системы межклетников, а также расположения хлоропластов и митохондрий у С3, С3-С4 промежуточных и С4 видов. Учитывая имеющиеся у коллектива данные по интенсивности фотосинтеза и транспирации, будет дана оценка значимости признаков для увеличения фотосинтетической фиксации углерода и минимизации потери воды при транспирации у растений с разным типом фотосинтеза. 3. Будет впервые на 3D уровне описаны особенности специфического положения хлоропластов и митохондрий в клетках мезофилла и обкладке пучка и его зависимость от биохимического подтипа у близкородственных С4 видов. Планируется выявить закономерности распределения органелл в объеме клетки относительно оси листа с учетом уровня экспрессии не только основных, но и дополнительных декарбоксилирующих ферментов. На основании этих данных будет оформлена публикация. 4. Специфичное для каждого биохимического подтипа С4 фотосинтеза селективное развитие тилакоидной системы хлоропластов и крист митохондрий будет впервые реконструировано на ультраструктурном уровне. Это позволит оценить ориентацию мембранной системы относительно оси листа (соответственно, относительно угла падения света) и сравнить с С3 злаками, у которых ориентация тилакоидов и гран кажется беспорядочной на двухмерных изображениях. 5. Будет оценена погрешность морфометрических измерений при использовании традиционных методов подсчета и с использованием SBF-SEM на примере параметров листа, связанных с уровнем фотосинтетической активности и перераспределением воды. Данные будут опубликованы в виде статьи.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Знание пространственной организации клеток и тканей необходимо не только для понимания их функционирования, но и для понимания становления биоразнообразия и эволюции живых организмов. В настоящее время идет интенсивная разработка методов структурной ботаники, способствующих переводу анатомического описания растительных объектов на 3D уровень. Одной из наиболее перспективных технологий объемной визуализации признается метод на основе серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM). В настоящем исследовании в 2022 были полностью подобраны и оптимизированы методики пробоподготовки к SBF SEM для растительных объектов, различающихся по структуре листа, с учетом конкретной цели объемной реконструкции (тканевой, клеточной, субклеточной). Разработаны варианты пробоподготовки для листа с мезоморфной структурой, злаков, суккулентов и хвойных растений. Методом SBF-SEM были получены пробные серийные срезы и массив изображений для последующей трехмерной реконструкции. Одной из задач проекта является апробация методики пространственной реконструкции тканей листа и мембранных структур органелл у представителей с разным типом фотосинтеза. Знание специфики пространственного взаиморасположения органелл поможет решить вопросы, связанные с эффективностью диффузии, концентрации и фиксации СО2 в системе С4 фотосинтетического цикла в зависимости от биохимического подтипа. С4 виды рода Panicum были выбраны для объемной реконструкции как имеющие представителей разных биохимических подтипов и классическое сочетание биохимического и анатомического подтипов, а виды рода Sporobolus являются удобной моделью для изучения эволюции С4 подтипов в трибе Zoysiea. На первом этапе проекта был определен уровень экспрессии трех декарбоксилирующих ферментов, на основании которого выявляется биохимический подтип С4 фотосинтеза. С использованием вестерн-блоттинга и его количественной оценки содержание основных и дополнительных декарбоксилаз оценен у четырех С4 видов рода Panicum, 15 видов рода Sporobolus и 2 видов близкородственного рода Zoysia. Подтверждено наличие всех трех известных биохимических подтипов среди видов рода Panicum. Среди 15 видов Sporobolus 5 принадлежат к ФЕП-КК биохимическому подтипу, 10 – к НАД-МЭ. У видов Zoysia, которые считаются ФЕП-КК С4 подтипом, впервые обнаружена значительная экспрессия НАДФ-МЭ как дополнительной декарбоксилазы. Сопоставление полученных данных и филогенетического распределения изученных видов показало, что в пределах трибы Zoysiea неоднородность по биохимическому подтипу свидетельствует о неоднократных случаях независимого возникновения С4 фотосинтеза в трибе. За отчетный период была получена полная характеристика анатомического строения ассимилирующей и водопроводящей тканей листа на уровне светового и электронного микроскопов на двухмерном уровне у четырех видов Panicum и 15 видов Sporobolus. Изученные виды, в основном, классифицированны как классические НАД-МЭ, НАДФ-МЭ и ФЕП-КК анатомические типы с двумя исключениями среди видов Sporobolus. Анализ серийных срезов листа С4 злаков, относящихся к двум разных анатомическим подтипам, показал, что клетки мезофилла, имеющие палисадную форму на поперечных срезах, имеют сложную лопастную форму на продольных и парадермальных плоскостях. До настоящего времени классификация С4 основывалась на двухмерных изображениях и насчитывает до 12 подтипов у злаков. Наши результаты свидетельствуют, что первые два классических структурных подтипа имеют сложную форму мезофилла на 3D уровне. Таким образом, наши результаты показывают, что Кранц анатомия у злаков имеет более комплексную природу, чем считалось до сих пор. Мы планируем провести проверку представителей остальных подтипов Кранц анатомии злаков, поскольку полагаем, что 3D форма клеток С4 злаков может рассматриваться как один из новых параметров при характеристике каждого анатомического подтипа С4 фотосинтеза. Важным направлением исследования при внедрении методов 3D визуализации является оптимизация измерений количественных параметров тканей и клеток, которые рассчитываются на единицу объема. В целях выявления погрешностей разных морфометрических методов, в 2022 на двухмерных изображениях были измерены количественные показатели, связанные с функцией фотосинтеза, для последующего сравнения с показателями объемных реконструкций. У шести видов злаков были измерены и подсчитаны структурные параметры, связанные с функцией фотосинтеза, транспирации и водопроведения. Особое внимание уделялось параметрам, связанным с проводимостью мезофилла, являющейся фактором, определяющим уровень фотосинтетической фиксации углерода и минимизации потери воды при транспирации. Такой параметр как число хлоропластов был оценен для клеток мезофилла листа хвойных растений на разных этапах морфогенеза. Поскольку для вечнозеленых характерна сезонная обратимая пролиферация и перемещение хлоропластов, этот пример позволяет в динамике оценить влияние положения и числа хлоропластов на функцию фотосинтеза. В дальнейшем, сравнение методик подсчета численных показателей на 2D и 3D уровнях позволит оперировать абсолютными значениями или выявить погрешность измерений.

 

Публикации