Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Знание пространственной организации клеток и тканей необходимо не только для понимания их функционирования, но и для понимания становления биоразнообразия и эволюции живых организмов. В настоящее время идет интенсивная разработка методов структурной ботаники, способствующих переводу анатомического описания растительных объектов на 3D уровень. Одной из наиболее перспективных технологий объемной визуализации признается метод на основе серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM). В настоящем исследовании в 2022 были полностью подобраны и оптимизированы методики пробоподготовки к SBF SEM для растительных объектов, различающихся по структуре листа, с учетом конкретной цели объемной реконструкции (тканевой, клеточной, субклеточной). Разработаны варианты пробоподготовки для листа с мезоморфной структурой, злаков, суккулентов и хвойных растений. Методом SBF-SEM были получены пробные серийные срезы и массив изображений для последующей трехмерной реконструкции. Одной из задач проекта является апробация методики пространственной реконструкции тканей листа и мембранных структур органелл у представителей с разным типом фотосинтеза. Знание специфики пространственного взаиморасположения органелл поможет решить вопросы, связанные с эффективностью диффузии, концентрации и фиксации СО2 в системе С4 фотосинтетического цикла в зависимости от биохимического подтипа. С4 виды рода Panicum были выбраны для объемной реконструкции как имеющие представителей разных биохимических подтипов и классическое сочетание биохимического и анатомического подтипов, а виды рода Sporobolus являются удобной моделью для изучения эволюции С4 подтипов в трибе Zoysiea. На первом этапе проекта был определен уровень экспрессии трех декарбоксилирующих ферментов, на основании которого выявляется биохимический подтип С4 фотосинтеза. С использованием вестерн-блоттинга и его количественной оценки содержание основных и дополнительных декарбоксилаз оценен у четырех С4 видов рода Panicum, 15 видов рода Sporobolus и 2 видов близкородственного рода Zoysia. Подтверждено наличие всех трех известных биохимических подтипов среди видов рода Panicum. Среди 15 видов Sporobolus 5 принадлежат к ФЕП-КК биохимическому подтипу, 10 – к НАД-МЭ. У видов Zoysia, которые считаются ФЕП-КК С4 подтипом, впервые обнаружена значительная экспрессия НАДФ-МЭ как дополнительной декарбоксилазы. Сопоставление полученных данных и филогенетического распределения изученных видов показало, что в пределах трибы Zoysiea неоднородность по биохимическому подтипу свидетельствует о неоднократных случаях независимого возникновения С4 фотосинтеза в трибе. За отчетный период была получена полная характеристика анатомического строения ассимилирующей и водопроводящей тканей листа на уровне светового и электронного микроскопов на двухмерном уровне у четырех видов Panicum и 15 видов Sporobolus. Изученные виды, в основном, классифицированны как классические НАД-МЭ, НАДФ-МЭ и ФЕП-КК анатомические типы с двумя исключениями среди видов Sporobolus. Анализ серийных срезов листа С4 злаков, относящихся к двум разных анатомическим подтипам, показал, что клетки мезофилла, имеющие палисадную форму на поперечных срезах, имеют сложную лопастную форму на продольных и парадермальных плоскостях. До настоящего времени классификация С4 основывалась на двухмерных изображениях и насчитывает до 12 подтипов у злаков. Наши результаты свидетельствуют, что первые два классических структурных подтипа имеют сложную форму мезофилла на 3D уровне. Таким образом, наши результаты показывают, что Кранц анатомия у злаков имеет более комплексную природу, чем считалось до сих пор. Мы планируем провести проверку представителей остальных подтипов Кранц анатомии злаков, поскольку полагаем, что 3D форма клеток С4 злаков может рассматриваться как один из новых параметров при характеристике каждого анатомического подтипа С4 фотосинтеза. Важным направлением исследования при внедрении методов 3D визуализации является оптимизация измерений количественных параметров тканей и клеток, которые рассчитываются на единицу объема. В целях выявления погрешностей разных морфометрических методов, в 2022 на двухмерных изображениях были измерены количественные показатели, связанные с функцией фотосинтеза, для последующего сравнения с показателями объемных реконструкций. У шести видов злаков были измерены и подсчитаны структурные параметры, связанные с функцией фотосинтеза, транспирации и водопроведения. Особое внимание уделялось параметрам, связанным с проводимостью мезофилла, являющейся фактором, определяющим уровень фотосинтетической фиксации углерода и минимизации потери воды при транспирации. Такой параметр как число хлоропластов был оценен для клеток мезофилла листа хвойных растений на разных этапах морфогенеза. Поскольку для вечнозеленых характерна сезонная обратимая пролиферация и перемещение хлоропластов, этот пример позволяет в динамике оценить влияние положения и числа хлоропластов на функцию фотосинтеза. В дальнейшем, сравнение методик подсчета численных показателей на 2D и 3D уровнях позволит оперировать абсолютными значениями или выявить погрешность измерений.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Знание пространственной организации клеток и тканей необходимо не только для понимания их функционирования, но и для понимания становления биоразнообразия и эволюции живых организмов. Одной из наиболее перспективных технологий объемной визуализации признается метод на основе серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM). Согласно задачам проекта, в 2023 была освоена работа с разными режимами сканирования VolumeScope2, подобраны оптимальные режимы для каждой задачи, получены серийные срезы и массивы изображений для трехмерной реконструкции. При работе над задачами проекта были изучены возможности комплекса программного обеспечения, состоящего из пакета Maps 3.9, который управляет получением серии изображений, и Amira 2020 3.1– программный комплекс для обработки изображений с возможностью трехмерной визуализации. Был разработан пошаговый протокол создания трехмерной реконструкции и определения объема компонентов клетки. Получены трехмерные реконструкции тканей листа и клеток мезофилла, составлены анимированные серии срезов. Одной из задач проекта является апробация методики пространственной реконструкции тканей листа, клеток мезофилла и мембранных структур органелл для решения вопросов, связанных с эффективностью диффузии, концентрации и фиксации углекислого газа при (1) сезонной динамике поглощения углекислоты и (2) в системе С4 фотосинтетического цикла. Показано, что для растений с неправильной формой клеток мезофилла двухмерная (2D) визуализация дает неполную, а иногда и вводящую в заблуждение, информацию о положении органелл. При этом информация о положении хлоропластов имеет решающее значение для понимания обмена CO2 и H2O внутри листа. За отчетный период были полученные массивы серийных срезов и созданы трехмерные реконструкции клеток мезофилла Pinus sylvestris на разных стадиях годичного цикла. Применение SBF SEM позволило выявить новые, не учтенные ранее, детали распределения клеток мезофилла с неправильной формой. Было визуализировано оптимальное положение хлоропластов в лопастных клетках: плотное расположение вдоль клеточных стенок, обращенных в межклетники. 3D реконструкция хлоропластов в период зимнего покоя позволила обнаружить детали структуры, которые упускали из виду ранее. Форма хлоропластов преобразуется из линзовидной в неправильную (амебоидную) с образованием многочисленных выростов, которые были определены как стромули. Исследование выявило новые условия (низкие температуры) для образования стромулей, которые также связаны с движением хлоропластов. Анализ серий показал, что сдвоенные тилакоиды в зимнее время представляют собой плоские цистерны, которые располагаются параллельно друг другу, с диаметром, сопоставимым с диаметром хлоропласта. Такая трёхмерная структура тилакоидной системы описана впервые. Известно, что таким образом снижается вероятность повреждения фотосистемы II, локализующейся в гранах, в результате фотоингибирования при сочетания низкой температуры и высокой инсоляции. В 2023 была закончена часть исследований по определению биохимического подтипа С4 злаков из разных филогенетических групп с количественным выражением экспрессии основных и дополнительных декарбоксилаз. Для трибы Zoysieae филогенетическая реконструкция показала множественные переключения между С4 фотосинтетическими подтипами ФЕП-КК и НАД-МЭ, причем ФЕП-КК, скорее всего, является анцестральной формой. Анализ климатических условий показал корреляцию между биохимическим подтипом и среднегодовыми осадками. Доказано, что множественная потеря ФЕП-КК декарбоксилазы в трибе могла быть вызвана аридизацией климата с последующими адаптивными изменениями в анатомии листа. Проведена оценка новых структурных параметров 8 типов Кранц анатомии, полученных на основе анализа трехмерного строения листа. Впервые на 3D уровне показано, что клетки мезофилла всех изученных видов имеют сложную лопастную форму в продольных и парадермальных плоскостях. Такая форма, скорее всего, влияет на проводимость мезофилла и гидравлику листа, однако требуются дальнейшие экспериментальные исследования. На 3D уровне были описаны особенности специфического положения хлоропластов и митохондрий в клетках мезофилла и обкладке пучка у С4 видов, относящихся к разным биохимическим подтипам (Panicum, Sporobolus, Disakisperma). Ранее Кранц анатомия была изучена только на поперечных двухмерных изображениях. У видов с НАД-МЭ декарбоксилазой хлоропласты расположены строго перпендикулярно к оси пучка в центрипетальной позиции, имеют округлую чрезвычайно уплощённую форму, при этом своей широкой поверхностью расположены параллельно поверхности листа. Митохондрии располагаются в один ряд между двумя хлоропластами. Такое пространственное положение является оптимальным для данного типа: НАД-МЭ декарбоксилаза локализуется в митохондриях, поэтому высвобожденный СО2 находится максимально близко к Рубиско хлоропластов и в то же время огражден вакуолью от возможности утечки в мезофилл. У НАДФ-МЭ типов хлоропласты располагаются перпендикулярно внешней клеточной стенке в центрифугальном положении и параллельно друг другу. У этого подтипа декарбоксилаза локализуется в хлоропластах, поэтому поступающие С4 метаболиты сразу оказываются в сайте декарбоксилирования. У ФЕП-КК типов (декарбоксилаза локализуется в цитозоле) хлоропласты чаще всего выстилают внешнюю стенку КО, располагаясь беспорядочно или частично упорядоченно. Для ФЕП-КК видов Sporobolus высокое содержание дополнительной декарбоксилазы НАД-МЭ коррелирует с необычным для подтипа развитием хондриома. В 2023 году были опробованы возможности программного обеспечения Amira для подсчета объема структур листа (в основном, межклетников и клеток мезофилла) или клетки (хлоропласты и митохондрии). Показано, что для выделенных при реконструкции объектов возможен автоматический подсчет их числа и объема. 3D методика особенно актуальна для клеток неправильной формы, а также при изменении формы органелл. Также была оценена возможность применения SBF-SEM для подсчетов параметров, связанных с проводимостью мезофилла, и погрешность при использовании 2D и 3D методик. Измерение площади поверхности клеточных стенок мезофилла, обращенных к межклетникам, может быть автоматизировано при выделении межклетников, однако поверхность хлоропластов, покрывающих клеточные стенки мезофилла, может быть подсчитана только при выделении вручную. При сравнении 3D и 2D количественных данных по объему межклетников на единицу объема листа показана 20% погрешность. Таким образом, метод SBF SEM дает возможность получения точных абсолютных величин количественных показателей при расчете на объем. Несмотря на существенные недостатки этого метода, такие как трудоемкость, временные затраты и высокая стоимость, 3D реконструкция является мощным инструментом при изучении структуры и функции ассимиляционных тканей растений.