КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-24-01179
НазваниеИсследование состояния и фазовых переходов фотосинтетических мембран и белковых молекул по изменению сжимаемости и поглощения ультразвука с помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины
РуководительЯныкин Денис Валерьевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук", г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2023 г. |
Конкурс№64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика
Ключевые словаУльтразвук, фазовые состояния, фазовые переходы, фотоситез, фотосистема 2, фотосинтетическое окисление воды, водоокисляющий комплекс
Код ГРНТИ34.31.05
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Одной из наиболее важных характеристик биологических мембран является их фазовое состояние, в том числе состояние белковых молекул, интегрированных в мембраны. Известно, что липиды, основные структурные компоненты биологических мембран, могут находиться в двух фазовых состояниях – жидком (жидкий кристалл) и твердом (гель). Точка фазового перехода зависит от многих факторов: структуры и упаковки липидных молекул, гидростатического давления, концентрации солей и так далее. Фазовые переходы липидных мембран лежат в основе важных биологических процессов: слияния клеток, осмоса, транспорта веществ и др. Белки также могут существовать в нескольких термодинамически устойчивых состояниях, например, нативное, развернутое клубкоподобное и компактное состояние расплавленной глобулы с потерей уникальной упаковки боковых цепей (последние два относят к денатурированным состояниям). Переходы этих состояний в белках тоже напоминают фазовые – при плавном изменении условий (температуры, рН или ионной силы) наблюдаются резкие изменения структуры белковой молекулы, причиной чего также является большое количество слабых взаимодействий, определяющих третичную структуру.
Данный проект посвящён изучению состояния и термо-/фото-/рН-индуцированных изменений точек фазовых переходов липидных и белковых компонентов препаратов, выделенных из фотосинтетических мембран на примере препаратов фотосистемы 2 (ФС2) (одного из важнейших и наиболее чувствительных к стрессовым факторам участков фотосинтетической электрон-транспортной цепи) различного структурно-функционального уровня. Основным методом исследования состояния и фазовых переходов данных препаратов предполагается регистрация изменения сжимаемости и поглощения ультразвука с помощью ранее разработанного членами коллектива [Асташев с соавт., 2014] ультразвукового спектрометра фиксированной длины, измерительная схема которого базируется на методах цифрового анализа гармонических сигналов. В рамках выполнения работ спектрометр будет адаптирован под потребности предполагаемых экспериментов и свойства образцов.
Исследования будут проводиться на препаратах фотосистемы 2 различного структурно-функционального уровня (мембранные фрагменты, насыщенные ФС2 (BBY-частицы), «ядерные» комплексы ФС2, D1/D2/cyt b559 реакционные центры и т.д.), а также на изолированных белках водоокисляющего комплекса ФС2. Будет исследовано влияние поэтапного удаления (и последующего связывания) этих белков, а также фотоформирования энзиматического неорганического ядра ВОК (имеющего структуру Mn4CaO5) на фазовые переходы липидных и белковых компонентов. Будет также проведено исследование физико-химических и биохимических характеристик липидов и белков этих препаратов при воздействии стрессовых факторов: высокой и низкой температуры, освещения высокой интенсивности, изменения рН, концентрации солей и осмолитов с целью выяснения свойств, предположительно необходимых для их функционирования в составе фотосистемы 2.
Таким образом, предполагаемые исследования можно условно разделить на два блока: (a) адаптация установки, имеющей в своём составе ультразвуковой спектрометр, для проведения экспериментов с фотосинтетическими образцами и (б) исследование свойств фотосинтетических мембран с помощью предложенного и классических методов. Планируемые исследования представляют как фундаментальный, так и практический интерес для понимания механизмов фотосинтеза, процессов лежащих в основе повреждения и восстановления фотосинтетического аппарата в результате действия на него повреждающих факторов. В ходе выполнения проекта будет модернизирована и впервые применена на фотосинтетических образцах установка, имеющая в своём составе цифровой компьютерный ультразвуковой спектрометр фиксированной длины и получены новые данные о процессах, происходящих в фотосинтетических мембранах. Полученные результаты могут быть использованы для разработки теоретических основ конструирования искусственных молекулярных преобразователей энергии, основанных на принципах природного фотосинтеза.
Ожидаемые результаты
Планируемые работы и ожидаемые результаты будут иметь большое фундаментальное и прикладное значение, и соответствовать самым высоким мировым стандартам, предъявляемым к научным исследованиям. В результате выполнения проекта впервые состояния и фазовые переходы фотосинтетических мембран и белковых молекул (а также их гидратация) будут оценены по изменению сжимаемости и поглощения ультразвука с помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины. При этом предполагается, что характеристики липидной и белковой фаз могут быть произведены в рамках одного измерения.
С применением нового подхода будут получены новые данные, необходимые для понимания функционирования, механизмов повреждения и восстановления фотосинтетического аппарата. Данные, которые предполагается получить, будут проанализированы в свете имеющихся в литературе публикаций, а выводы будут подкрепляться результатами, полученными с использованием других методов и подходов. Помимо этого, модернизированная в рамках выполнения проекта установка впоследствии может быть использована для проведения работ как с другими фотосинтетическими образцами (в том числе выделенными из других организмов), так и остальными типами препаратов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках работ по проекту были выделены и охарактеризованы препараты, которые будут использованы для выполнения исследований. В отчётном году была выполнена модернизация ультразвукового спектрометра фиксированной длины, которая позволяющая проводить измерения теплового и фотоиндуцированного повреждения пигмент-белковых комплексов ФС2. Мы реализовали схему измерения с использованием цифрового анализа гармонических сигналов. Модернизация ультразвукового спектрометра включала: увеличение быстродействия, подведение освещения к ячейкам пробы, реализацию возможности смены газовой атмосферы и перемешивания пробы. В отчётном году ультразвуковой спектрометр фиксированной длины был применён для определения кинетики теплового и фотоиндуцированного повреждения биологических мембран и белковых комплексов, а также были выполнены тестовые измерения. При использовании растворов, содержащих естественные концентрации оксида дейтерия, показана высокая чувствительность спектрометра. Спектрометр хорошо зарекомендовал себя при измерении фазового состояния димиристоилфосфатидилхолиновых липосом как в отсутствие, так и в присутствии добавок, способных изменять свойства липидов (додецилсульфат натрия, пальмитиновая кислота и ионы кальция). С помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины были продемонстрированы тепло- и фотоиндуцированные изменения состояния препаратов фотосистемы 2 различного структурно-функционального уровня. Для «ядерных» комплексов ФС2 выявлены переходы при 35,5, 43,5, 56,5 и 66,7 градуса Цельсия. Для препаратов ФС2 BBY-типа аналогичные переходы выявлены при 42,0, 51,5, 59,2 и 67,1 градуса Цельсия. У D1/D2/cyt b559 комплексов ФС2 переход обнаружен только при 58,5 градуса Цельсия. Предполагается, что переходы отражают разборку комплексов и денатурацию белков. Таким образом, наше исследование демонстрирует возможность применения ультразвукового спектрометра фиксированной длины для определения кинетики теплового и фотоиндуцированного повреждения биологических мембран и белковых комплексов.
Публикации
1. Яныкин Д.В., Асташев М.Е., Хоробрых А.А., Пасхин М.О., Серов Д.А., Гудков С.В. Application of Fixed-Length Ultrasonic Interferometry to Determine the Kinetics of Light-/Heat-Induced Damage to Biological Membranes and Protein Complexes Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 7, 4, 87 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/inventions7040087
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчётный период были проведены исследования температурной зависимости удельного изменения скорости звука и удельного поглощения в препаратах фотосистемы 2, подвергшихся обработкам, приводящим к поэтапному разрушению ВОК, ингибирующему действию повреждающих факторов, а также процедуре фотоформирования функционально активного Mn4CaO5-кластера в препаратах с разрушенным ВОК. Выявлено, что поэтапное удаление белков водоокисляющего комплекса PsbP, PsbQ и PsbO и последующее полное разрушение Mn4CaO5-кластера приводит к постепенному уменьшению амплитуды перехода А2 вплоть до его полного исчезновения, а также пропаже перехода С уже на этапе удаления всех белков ВОК. Показано, что в результате действия всех повреждающих факторов повышается относительная скорость ультразвука и начальное значение добротности, что свидетельствует о повреждении ВОК и диссоциации его внешних белков из препаратов ФС2. Уменьшение после фотоингибирования амплитуды перехода А, и его растягивание во времени свидетельствует о повреждении белков реакционного центра в препаратах ФС2. Показано, что степень повреждений, определяемая с помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины увеличивается в присутствии в среде измерения молекулярного кислорода. Эти результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый нами метод позволяет оценивать состояние ВОК и белков реакционного центра при различных воздействиях на препараты ФС2.
Показано, что осмолиты повышают эффективность фотоактивации кислород-выделяющей функции препаратов ФС2 с разрушенным ВОК. Oсобенно выраженным действием обладают дисахарида сахароза и трегалоза. С помощью классических методов и ультразвукового спектрометра фиксированной длины выявлено, что действие осмолитов обусловлено, во-первых, повышением способности РЦ ФС2 окислять Mn2+, во-вторых защитой от фотоингибирования, в-третьих, повышением стабильности ВОК и вновь собранного неорганического Mn4CaO5-кластера, и, в-четвёртых, поддержанием эффективного электронного транспорта в РЦ ФС2.
Таким образом, продемонстрирована высокая эффективность применения ультразвукового спектрометра фиксированной длины для исследования кинетики теплового и фотоиндуцированного повреждения фотосинтетических препаратов различного структурно-функционального уровня.
Публикации
1. Яныкин Д.В., Казанцева Д.В., Хоробрых А.А. Effect of Osmolytes on Photoassembly of Functionally Active Mn4CaO5 Cluster in Mn-depleted Photosystem II Preparations Isolated from Spinach Leaves Horticulturae, - (год публикации - 2023)
Возможность практического использования результатов
Разработанный участниками проекта ультразвуковой спектрометр фиксированной длины имеет потенциал применения для анализа суспензий и растворов в непрерывном режиме в нефтегазовой отрасли, пищевой и фармацевтической промышленности, а также в научных исследованиях.