КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-24-20018

НазваниеРазработка способа получения персонализированной вакцины на основе загруженных опухоль-специфичными антигенами дендритных клеток для терапии онкологических заболеваний

РуководительКитаева Кристина Викторовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2023 г.

Конкурс№65 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые словаПерсонализированная медицина, терапевтическая вакцина, дендритные клетки, иммунотерапия, индуцированные мембранные везикулы, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Код ГРНТИ62.33.31

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Иммунотерапевтические методы открыли новые возможности лечения онкологических заболеваний. Немалую роль в развитии данных методов сыграли терапевтические противоопухолевые вакцины, в частности дендритные вакцины (Filin et al., 2020, doi: 10.3390/biomedicines8120621). Механизм действия дендритных вакцин заключается в стимуляции и поддержке иммунного ответа, направленного исключительно на элиминацию опухолевых клеток организма. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК), так как наряду с макрофагами и B-клетками имеют на поверхности мембраны молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ)-II. Но только ДК, благодаря способности мигрировать в лимфатические узлы, имеют возможность активировать Т-киллеры – основные клетки противоопухолевого иммунного ответа (Allan et al., 2006, doi: 10.1016/j.immuni.2006.04.017; Sanchez-Sanchez et al., 2006, doi: 10.4049/jimmunol.176.9.5153). Данное обстоятельство делает ДК важным звеном, связывающим врожденный и адаптивный иммунитет. Персонализированные вакцины на основе аутологичных (собственных) дендритных клеток являются безопасным методом, использующимся при комплексной противоопухолевой терапии, усиливая терапевтический эффект химиотерапии (Ogasawara et al., 2021, doi: 10.1111/1744-9987.13659) или других иммунотерапевтических методов, таких как иммунные ингибиторы контрольных точек (van Willigen et al., 2020, doi: 10.1080/2162402X.2020.1738814). Безопасность данных вакцин подтверждена многочисленными клиническими испытаниями I и II фазы (ClinicalTrials.gov), в которых зарегистрирована низкая токсичность, характеризующаяся в основном побочными эффектами 1 и 2 степени (головная боль, тошнота, потеря аппетита, диарея, утомляемость, озноб, раздражение, эритема и отек в местах инъекций). Также было установлено, что данные вакцины обладают пролонгированным противоопухолевым эффектом, сдерживая развитие заболевания. Таким образом, дендритные вакцины могут стать важным инструментом при терапии солидных опухолей, способствующим модуляции таргетного противоопухолевого Т-клеточного ответа. В настоящем проекте в качестве новой технологии терапии онкологических заболеваний человека рассматривается подход создания персонализированной терапевтической вакцины на основе ДК, загруженных опухоль-специфичными антигенами (ОСА) с помощью индуцированных мембранных везикул (иМВ). Уникальность подхода заключается в загрузке ДК опухоль-специфичными антигенами при помощи иМВ, а также методе получения иМВ из опухолевых клеток с помощью обработки клеток цитохалазином Б – данное вещество препятствует полимеризации актиновых филаментов, вызывая дезорганизацию цитоскелета, что позволит получать мембранные везикулы в повышенном количестве. Мембранные везикулы представляют собой мембраносвязанные структуры различных размеров и выделяемые клетками разных типов. Они содержат широкий спектр биоактивных молекул, включая белки, липиды, ядерные и митохондриальные компоненты. Мембранные везикулы выполняют ряд важных функций, связанных с межклеточной коммуникацией, влияющих на множественные клеточные процессы. Данная способность опосредована возможностью мембранных везикул сливаться с клетками-реципиентами посредством эндоцитоза. Естественные мембранные везикулы выделяются клетками, в том числе опухолевыми, в малых количествах, поэтому в данном проекте было принято решение проводить обработку опухолевых клеток цитохалазином Б, известного своим стимулирующим действием на формирование иМВ. Преимуществом разрабатываемого способа презентации ОСА является простота выделения и применения иМВ для загрузки ДК.

Ожидаемые результаты
В настоящем проекте будет оптимизирован протокол получения дендритных клеток (ДК) из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) доноров путем направленной дифференцировки цитокинами. Впервые будут получены перевиваемые линии опухолевых клеток со сверхэкспрессией GM-CSF при помощи генетической модификации с использованием лентивирусного вектора с подтвержденной экспрессией трансгенов. Впервые будет разработана биотехнология выделения индуцированных цитохалазином В мембранных везикул (иМВ), в качестве опухоль- специфичных антигенов (ОСА), из перевиваемых линий опухолевых клеток со сверхэкспрессией GM-CSF и оптимизация протокола их загрузки в зрелые ДК. Будут получены уникальные данные о функциональной активности терапевтической противоопухолевой вакцины на основе ДК, а именно о ее способности активировать иммунные клетки для направленного уничтожения опухолевых клеток in vitro. Будут получены данные о жизнеспособности и изменении цитокинового профиля опухолевых клеток после взаимодействия с активированными иммунными клетками. Будет оптимизирован протокол получения стабильных первичных культур опухолевых клеток из биоптатов опухолевой ткани человека. Будут получены данные о данные о фенотипе и кариотипе стабильных первичных культур опухолевых клеток. Впервые будут получены иМВ из стабильных первичных культур опухолевых клеток для активации зрелых ДК. Будут получены уникальные данные о функциональной активности терапевтической противоопухолевой вакцины на основе ДК на иммунных клетках доноров и первичных линиях опухолевых клеток, полученных из биоптатов. Полученные результаты внесут значительный вклад в понимание механизмов модуляции иммунного ответа зрелыми дендритными клетками, загруженными опухоль-специфичными антигенами, и их участие в формировании противоопухолевого иммунитета. Полученные данные позволят разработать новые подходы в персонализированной иммунотерапии злокачественных новообразований на основе дендритных клеток, загруженных искусственными мембранными везикулами из генетически-модифицированных опухолевых клеток.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для генетической модификации клеток меланомы линии М14 были собраны лентивирусные векторы c множественностью инфекции 10, кодирующие ген белка GM-CSF. В результате лентивирусной трансдукции были получены клетки меланомы линии М14 со сверхэкспрессией белка GM-CSF (М14-GM-CSF), наличие белка в клетках было подтверждено вестерн-блот анализом, ПЦР в реальном времени, а также анализом при помощи иммуноцитохимии. Для получения опухоль-специфичных антигенов (ОСА) из нативных клеток линии М14 и М14-GM-CSF были выделены индуцированные цитохалазином-В мембранные везикулы (иМВ-М14 или иМВ-M14-GM-CSF) путем последовательного центрифугирования. Были получены данные о размере иМВ (220 до 240 нм), а также данные о наличии белка GM-CSF в выделенных из М14-GM-CSF иМВ при помощи вестерн-блота и ПЦР-РВ. Таким образом, была получена перевиваемая линия опухолевых клеток со сверхэкспрессией GM-CSF при помощи генетической модификации с использованием лентивирусного вектора и разработан регламент выделения иМВ, в качестве ОСА, из перевиваемых линий опухолевых клеток со сверхэкспрессией GM-CSF. Из цельной крови донора были выделены мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). Для получения дендритных клеток (ДК), из выделенных МКПК были отобраны моноциты путем адгезивной сепарации, которые культивировались в среде с добавлением факторов IL-4 и GM-CSF в первые 4 суток и добавлением ОСА (200 мкг/мл иМВ-М14 или иМВ-M14-GM-CSF) и факторов IL-6, IL-1β, TNF-α, PGE2 на 6-е сутки культивирования. В результате дифференцировки моноцитов в ДК (моДК), было показано увеличение популяции клеток с характерным для моДК иммунофенотипом CD3-CD19-CD20-CD56-HLA-DR+CD64+CD11c+ на 65%, популяция активированных моДК с фенотипом CD3-CD19-CD20-CD56-HLA-DR+CD64+CD11c+CD80+CD83+ составила 56% и 64% от общей популяции при загрузке моДК иМВ-М14 и иМВ-M14-GM-CSF, соответственно. Таким образом, разработан и оптимизирован протокол получения дендритных клеток из МКПК доноров при помощи направленной дифференцировки цитокинами и оптимизирован протокол загрузки ОСА в зрелые дендритные клетки. Было показано, что полученные совместное культивирование загруженных иМВ-M14-GM-CSF моДК с нативными МКПК приводило к увеличению HLA-DR CD38+ ЦТЛ в культуре МКПК на 43% относительно контрольных МКПК. Также показано, что активированные МКПК, в результате совместного культивирования с загруженными моДК, обладали цитотоксической активностью в отношении клеток меланомы линии М14, приводя к увеличению апоптотических опухолевых клеток на 20%, а также к увеличению концентрации ряда цитокинов/хемокинов (IL-1b, IL-6, IL-8, IL-10, Gro-a/CXCL1, MIP-1a/CCL3, Gro-b/CXCL2, ENA-78/CXCL5, TNFa) в кондиционированной среде. Таким образом, была исследована функциональность терапевтических противоопухолевых вакцин в системе in vitro на иммунных клетках доноров и перевиваемой линии клеток меланомы.

Публикации

1. Филин И.Ю., Китаева К.В., Чулпанова Д.С., Ризванов А.А., Ахметзянова Э.Р., Соловьева В.В. Tumor-Derived Membrane Vesicles from the IL-2 Overexpression Melanoma Cells Affect on the Expression of Surface Markers of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells In Vitro Springer Nature, Filin, I.Y., Kitaeva, K.V., Chulpanova, D.S. et al. Tumor-Derived Membrane Vesicles from the IL-2 Overexpression Melanoma Cells Affect on the Expression of Surface Markers of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells In Vitro. BioNanoSci. (2022). (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/s12668-022-01044-3

2. Филин И.Ю., Китаева К.В., Ризванов А.А., Соловьева В.В. Современное состояние и перспективы развития иммунотерапии онкологических заболеваний с применением дендритных вакцин УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ, - (год публикации - 2022) https://doi.org/10.26907/2542-064X.2022.3.347-366

3. Китаева К.В., Филин И.Ю., Городилова А.В., Маясин Ю.П., Харисова Ч.Б., Чулпанова Д.С., Соловьева В.В., Ризванов А.А. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЗАГРУЖЕННЫХ ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИГЕНАМИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO Гены и клетки, Гены и клетки. – №3. –Том 17. – 2022. – С.108 (год публикации - 2022)

4. Филин И.Ю., Китаева К.В., Городилова А.В., Маясин Ю.П., Харисова Ч.Б., Чулпанова Д.С., Соловьева В.В., Ризванов А.А. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИНДУЦИРОВАННЫХ МЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК СО СВЕРХЭКСПРЕССИЕЙ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 IN VITRO Гены и клетки, Гены и клетки. – №3. –Том 17. – 2022. – С.241-242 (год публикации - 2022)

5. Филин И.Ю., Китаева К.В., Чулпанова Д.С., Гилазиева З.Е., Соловьева В.В., Ризванов А.А. Analysis of immune cell activation after interaction with membrane vesicles from genetically modified tumor cells European Journal of Clinical Investigation, Filin I., Kitaeva K., Chulpanova D., Gilazieva Z., Solovyeva V., Rizvanov A., Analysis of immune cell activation after interaction with membrane vesicles from genetically modified tumor cells//EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION. – 2022. – Vol. 52. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13795

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В результате 2 года работы были получены и охарактеризованы первичные культуры опухолевых клеток, выделенных из биоптатов опухоли молочной железы. При помощи проточной цитофлуориметрии, у выделенных клеток была подтверждена высокая представленность поверхностного маркера CD44 (98,6%) и отсутствие маркера CD24, что также характерно для коммерческой линии клеток аденокарциномы MDA-MB-231, а также для мезенхимных стволовых клеток. Для подтверждения опухолевой природы выделенных из биоптатов опухоли молочной железы клеток была показана экспрессия онкомаркера Ki-67 при помощи иммуноцитохимического анализа и конфокальной микроскопии. Было показано, что уровень пролиферативной активности первичных опухолевых клеток, выделенных из биоптата опухоли молочной железы в сравнении с коммерческой линией клеток MCF-7, был выше на промежутках в 24, 48 и 72 часа, но имел тенденцию к снижению. Также было показано, что уровень метаболической активности первичных опухолевых клеток, выделенных из биоптата опухоли молочной железы, не имеет значимых отличий от метаболической активности клеток линии MCF-7 после 48 часов культивирования. В качестве опухоль-специфичных антигенов в данной работе (ОСА) были использованы индуцированные цитохалазином Б мембранные везикулы, выделенные из первичных опухолевых клеток биоптата опухоли молочной железы. По ранее разработанному протоколу были получены моноцитарные дендритные клетки из популяции моноцитов периферической крови человека в результате их направленной дифференцировки, после чего была проведена загрузка ОСА из первичных опухолевых клеток, выделенных из биоптата опухоли молочной железы. Проведен анализ активации и цитотоксической активности мононуклеарных клеток после совместного культивирования с активированными моноцитарными дендритными клетками. Показано увеличение количества HLA-DR CD38+ ЦТЛ у всех опытных образцов при использовании ОСА как из первичных опухолевых клеток, выделенных из биоптата опухоли молочной железы, так и при использовании ОСА из клеток линии MCF-7 более чем на 60%, относительно нативных МКПК, кроме того, активация ЦТЛ в образцах после антигенпрезентации ДК-ОСА была выше, чем при активации МКПК при помощи фитогемагглютинина. Не было показано выраженного цитотоксического эффекта на первичные опухолевые клетки, выделенные из биоптата опухоли, при инкубации с активированными мононуклеарными клетками, после взаимодействия с загруженными опухоль- специфичными антигенами моноцитарных дендритных клеток. Отсутствие выраженного цитотоксического действия на клетки, выделенные из биоптата опухоли молочной железы, вероятно, может объясняться высокой гетерогенностью полученных клеток. Для увеличения эффекторного потенциала ЦТЛ в данной культуре требуются дополнительные исследования. Проведен анализ цитокинового профиля первичных опухолевых клеток после взаимодействия с активированными МКПК. При анализе кондиционированной среды, собранной опухолевых клеток после взаимодействия с активированными МКПК, было показано увеличение провоспалительных цитокинов/хемокинов – IL-1b, IL-6, IL-8, TNFa. Увеличение секреции данных факторов может указывать на компенсаторное увеличение метастатического и пролиферативного потенциала первичных опухолевых клеток в ответ на взаимодействие с МКПК.

Публикации

1. Городилова А.В., Китаева К.В., Филин И.Ю., Маясин Ю.П., Харисова Ч.Б., Исса Шаза С., Соловьева В.В., Ризванов А.А. The Potential of Dendritic Cell Subsets in the Development of Personalized Immunotherapy for Cancer Treatment MDPI, The Potential of Dendritic Cell Subsets in the Development of Personalized Immunotherapy for Cancer Treatment. Curr. Issues Mol. Biol. 2023, 45, 8053-8070. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cimb45100509

2. Филин И.Ю., Маясин Ю.П., Харисова К.Б., Городилова А.В., Китаева К.В., Чулпанова Д.С., Соловьева В.В., Ризванов А.А. Cell Immunotherapy against Melanoma: Clinical Trials Review MDPI. International Journal of Molecular Sciences., Filin, I.Y.; Mayasin, Y.P.; Kharisova, C.B.; Gorodilova, A.V.; Kitaeva, K.V.; Chulpanova, D.S.; Solovyeva, V.V.; Rizvanov, A.A. Cell Immunotherapy against Melanoma: Clinical Trials Review. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 2413. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24032413

3. Филин И.Ю., Маясин Ю.П., Харисова С.Б., Городилова А.В., Чулпанова Д.С., Китаева К.В., Ризванов А.А., Соловьева В.В. T-Lymphocytes Activated by Dendritic Cells Loaded by Tumor-Derived Vesicles Decrease Viability of Melanoma Cells In Vitro MDPI. Current Issues in Molecular Biology, Curr. Issues Mol. Biol. 2023, 45, 7827-7841. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cimb45100493

4. - Ученые КФУ предложили персонализированный подход к лечению меланомы Медиапортал КФУ, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
не указано