Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Собраны, зафиксированы в растворе 3% глутаральдегида и 2% параформальдегида и заключены в смесь эпоксидных смол эпона и аралдита и в парафиновую среду вегетативные побеги хвощовых (Equisetales, Polypodiopsida) Equisetum fluviatile L. и E. sylvaticum; плауновидных Huperzia selago (L.) Bernh. ex Schrank (Lycopodiales, Lycopodiopsida) и Selaginella kraussiana (Kuntze) A. Braun (Selaginellales, Isoetopsida); лептоспорангиатных папоротниковидных Pteridium aquilinum (L.) Kuhn (Dennstaedtiaceae, Polypodiopsida), Dryopteris carthusiana (Vill.) H. P. Fuchs. (Dryopteridaceae, Polypodiopsida) и Athyrium filix-femina (L.) Roth (Aspidiaceae, Polypodiopsida). Изготовлены продольные серийные срезы верхушек побегов всех собранных плауновидных, хвощовых и лептоспорангиатных папоротников. На базе ресурсного центра СПбГУ "Развитие молекулярных и клеточных технологий" https://researchpark.spbu.ru/biomed-rus изготовлены ультратонкие срезы апикальных меристем H. selago, S. kraussiana, P. aquilinum, D. carthusiana и A. filix-femina. Проведено сравнительное изучение апикальных меристем побегов (АМП) плауновидных и папоротниковидных. Наряду с присутствием единственной тетраэдрической апикальной инициали (АИ) и сходных зон поверхностных (ПИ) и подповерхностных (ППИ) инициалей у обоих групп растений, выявлены следующие различия между моноплексными АМП плауновидного S. kraussiana и лептоспорангиатных папоротниковидных P. aquilinum, D. carthusiana и A. filix-femina: отсутствие/наличие (соответственно) связи неравных периклинальных делений ПИ с укорочением клеток, отсутствие/наличие (соответственно) чашевидной зоны. В симплексной АМПt плауновидного H. selago не одна, а несколько АИ, присутствуют сходные с моноплексной АМП зоны ПИ и ППИ; отсутствует чашевидная зона. В моноплексной АМП путем определения принадлежности клеток к мерофитам, находящимся на разном удалении от АИ восстановлена последовательность делений в каждом из мерофитов (клеточные линии). Этот подход позволил при сравнении ультраструктуры клеток, относящихся к разным зонам в АМП моноплексного типа, дополнительно оценить примерное число и направление делений, которое произошло в ходе смещения этих клеток от АИ. В результате было выявлено, что клетки моноплексных АМП плауновидного S. kraussiana и лептоспорангиатных папоротниковидных P. aquilinum, D. carthusiana и A. filix-femina различаются по степени вакуолизации, отсутствию/наличию (соответственно) липидов в цитоплазме и крахмала в пластидах вокруг ядра, а также однородности/неоднородности (соответственно) ультраструктуры ПИ, которые претерпели разное число периклинальных делений. Вакуолизация клеток симплексной АМП плауновидного H. selago так же, как количество пластид с кархмальными зернами и липидов незначительны и сходны с таковыми у плауновидного S. kraussiana. В целом ультраструктура клеток моноплексной АМП плауновидного S. kraussiana более сходна с таковой в симплексной АМП плауновидного H. selago, чем в моноплексной АМП папоротниковидных P. aquilinum, D. carthusiana и A. filix-femina. В стенках АИ и ближайших к ней клеток моноплексной АМП как папоротниковидных P. aquilinum, D. carthusiana и A. filix-femina, так и плауновидного S. kraussiana выявлено большое количество исключительно неветвящихся плазмодесм. На примере папоротниковидного P. aquilinum показано, что плотность распределения плазмодесм в клеточных стенках снижается по мере удаления клеток от АИ. Эти данные, вероятно, свидетельствуют о том, что плазмодесмы этих растений образуются только во время цитокинеза. В стенках клеток симплексной АМП H. selago обнаружены как неветвящихся, так и ветвящихся плазмодесм; их плотность существенно ниже, чем в моноплексной АМП и не различается в стенках клеток, относящихся к разным зонам. Это позволяет предположить, что плазмодесмы у H. selago образуются как во время цитокинеза, так и пост-цитокинетически. Полученные данные позволяют заключить, что структурные особенности клеток моноплексных АМП плауновидных и лептоспорангиатных папоротниковидных различаются. Результаты исследования можно рассматривать как аргументы в пользу исходности симплексной АМП у спорофитов высших растений и независимой реверсии к моноплексному типу у плауновидных из пор. Selaginellales и большинства папоротниковидных. Данная реверсия, предположительно, явилась следствием утраты в этих группах несеменных растений механизма пост-цитокинетического формирования плазмодесм Начат биоинформатический поиск гомологов транскрипционных факторов (ТФ), регулирующих морфогенез адаксиального и абаксиального доменов листьев, а также маргинальнй и пластинчатой меристем пластинки листа (WOX, ARP, C3HDZ, YABBY и KANADI) в базах данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), OneKP (https://sites.google.com/a/ualberta.ca/onekp/), UniPort (https://www.uniprot.org/help/uniprotkb) и China National GeneBank DataBase (CNGBdb) (https://db.cngb.org/); данные о геноме Anthoceros agrestis взяты с ресурса https://www.hornworts.uzh.ch/en/hornwort-genomes.html. Поиск проводился в транскриптомах хвощовых (Equisetidae) и представителей других таксонов папоротниковидных, а также у голосеменных и цветковых растений. Анализировались только транскриптомы, для которых тип растительного материала которых был обозначен как: “tips of shoots” – верхушки и “developing shoots” – развивающиеся стебли, "young leaves" - молодые листья. Поиск гомологов белков осуществляли в базе данных OneKP (https://sites.google.com/a/ualberta.ca/onekp/), используя алгоритмы tBLASTn и BLASTp на сайте национального генбанка Китая https://db.cngb.org/onekp/, где доступны различные функции алгоритма BLAST. Отбор последовательностей осуществляли на основании литературных данных о структурной организации консервативных доменов, литературных данных об идентифицированных последовательностях у разных организмов, а также основываясь на данных hmmer, опция HMMERSCAN (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer), осуществляющая поиск по разным базам данных, в данном исследовании – Pfam, содержащей информацию о доменах в последовательности. Для поиска консервативных мотивов использовалась онлайн версия MEME Suite 5.4.1 (Timothy et al., 1994, https://meme-suite.org/meme/index.html). Предварительный биоинформатический поиск выявил в транскриптомах Equisetidae, Psilotidae, Ophioglossidae, Marattiidae и Polypodiidae гомологи следующих ТФ: WOX древней (T1) клады, но не современной (WUS/WOX или Т3) клады и по одному (из двух известных для семенных растений) гомологу, регулирующему дифференцировку адаксиального (C3HDZ) и абаксиального (KANADI) доменов листа. По результатам работы публикована статья "СТРОЕНИЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ ПОБЕГОВ И ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ИХ КЛЕТОК У ПЛАУНОВИДНЫХ И ПАПОРОТНИКОВИДНЫХ". Ботанический журнал, 2022, т. 107, No 9, с. 885–905. Материалы исследования докладывались на а V (XIII) Международной ботанической конференции молодых учёных в Санкт-Петербурге 25–29 апреля 2022 года https://www.binran.ru/files/conferences/IBC/IBC_2022_Programme_ver_3.pdf и Всероссийской конференции по естественным и гуманитарным наукам с международным участием «Наука СПбГУ-2022» https://events.spbu.ru/events/anons/science-2022/program.html. Информация о ходе выполнения проекта опубликована на сайте СПбГУ https://spbu.ru/news-events/novosti/botaniki-spbgu-priblizilis-k-razresheniyu-voprosa-ob-ishodnom-tipe-obrazovaniya и биологического факультета СПбГУ https://bio.spbu.ru/news/detail.php?ID=5965 .

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящее исследование выполнено в рамках разработки вопроса о гомологии редуцированных листьев хвощовых (Equisetidae, Polypodiophyta) и листьев "типичных" папоротниковидных (Polypodiidae, Polypodiophyta). Поскольку листья образуются в апикальных меристемах побегов (АМП), методами световой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии изучены строение АМП и ультраструктурные особенности её клеток, а также заложение и развитие листьев у Equisetum sylvaticum - хвоща лесного и E. fluviatile - хвоща приречного. Электронная микроскопия выполнена на базе ресурсного центра СПбГУ "Развитие молекулярных и клеточных технологий" https:/researchpark.spbu.ru/biomed-rus. Анализ серийных срезов апикальных меристем побегов АМП Equisetum sylvaticum и E. fluviatile выявил, что они относятся к моноплексному структурному типу. Единственная апикальная инициаль (АИ) располагается в поверхностном слое и делится косоантиклинально, образуя клетки призматической формы, называемые мерофитами. Картирование клеточных линий позволило выявить, что три последовательных мерофита полностью опоясывают апекс побега; их дальнейшие деления скоординированы между собой. Анализ ультратонких срезов Е. sylvaticum и Е. fluviatile показал относительно невысокую степень вакуолизации и структурную однородность поверхностных инициалей, наличие в их пластидах единичных крахмальных зерен и единичных липидных капель в цитоплазме. В стенках АИ E. fluviatile и ее ближайших производных было выявлено большое количество неветвящихся плазмодесм, а подсчет их числа на 20 мкм клеточной стенки показал, что оно сходно с таковым у изученных в рамках выполнения проекта в 2022 году плауновидных и папоротниковидных с моноплексной АМП. Анализ продольных и поперечных срезов верхушек побегов, дополненный изучением почек с помощью сканирующего электронного микроскопа позволил выявить закономерности развития элементарных метамеров побегов. Выявлено, что инициация листьев E. sylvaticum и E. fluviatile сходна с таковой у других растений с моноплексной апикальной меристемой, а основная особенность органогенеза хвощовых – заложение мутовки листьев как единой структуры. Прекращение функционирования апикальной меристемы листа, обусловленное вакуолизацией его апикальной инициали, приводит к ранней остановке роста листовой пластинки и отсутствию в ней маргинальной меристемы и проводящих тканей. Незначительное увеличение размеров листовых пластинок в проксимодистальном направлении (в длину) происходит преимущественно вследствие растяжения слагающих их клеток и отчасти – за счет деления клеток в основании мутовок. Число клеток в ад/абаксиальной (в толщину) и медиолатеральной (в ширину) плоскостях сформированных пластинок листьев такое же, как в их зачатках. Это косвенно свидетельствует о том, что маргинальная и пластинчатая меристемы в листовых пластинках обоих видов хвощей отсутствуют. Рост мутовки, образованной сросшимися основаниями листьев, в проксимодистальном направлении происходит за счет скоординированных тангентальных делений клеток периферической части интеркалярной меристемы. Было установлено, что элементарный метамер обоих видов хвощей имеет сходное строение и состоит из мутовки сросшихся основаниями листьев и мутовки почек, эндогенно возникающих между листовыми пластинками, но дальнейшее развитие почек E. sylvaticum и E. fluviatile различается. Апикальная меристема почки E. sylvaticum начинает функционировать сразу же после возникновения, тогда как у E. fluviatile - только на значительном удалении от АМП. На основании сравнительного анализа серий продольных и поперечных срезов апексов побегов описаны клеточные аспекты морфогенеза листьев у H. selago (Lycopodiales) и S. kraussiana (Selaginellales), лептоспорангиатных папоротниковидных (Polypodiidae) и хвощовых Е. sylvaticum и Е. fluviatile (Equisetidae) охарактеризована роль роль апикальной, маргинальной, интеркалярной и пластинчатой меристем листа у представителей этих таксонов. Установлено, что органогенез изученных папоротниковидных и плауновидных коррелирует со структурным типом АМП: у Equisetidae, Polypodiidae и Selaginellales с моноплексной АМП он начинается с возникновения апикальных инициалей листьев (АИЛ); в симплексной АМП Lycopodiales - c пролиферации группы клеток. Различия в морфогенезе и морфологии листьев определяется спецификой функционирования листовых меристем. Ключевую роль в морфогенезе листа Polypodiidae играют апикальная меристема листа и маргинальная меристема, образующая апикальные инициали перьев и перышек. Ранняя остановка морфогенеза листьев Equisetidae и Psilotales – следствие вакуолизации АИЛ и её производных, в результате которой в зачатках листьев не возникают маргинальная и пластинчатая меристемы. В листьях Selaginellales и Lycopodiales кратковременно функционируют апикальная, маргинальная и пластинчатая меристемы. Для выявления сходства и различий в регуляции морфогенеза различающихся по морфологии и анатомии листьев Equisetidae и Polypodiidae в геномах представителей всех таксонов несеменных растений проведен поиск гомологов регуляторов маргинальной (WOX3) и пластинчатой (WOX1) меристем листа, а также регуляторов развития его адаксиального (ARP, C3HDZ или HD-Zip III класса) и абаксиального (YABBY, KANADI) доменов; реконструирована их филогения. Проведенное исследование показало, что у всех папоротниковидных (Equisetidae, Polypodiidae, Ophioglossidae) имеется единственный регулятор адаксиального (C3HDZ) и единственный регулятор абаксиального (KANADI) доменов листа. Наличие гомологов C3HDZ и KANADI у представителей всех таксонов высших растений как гаметофитной, так и спорофитной линии эволюции указывает на то, что они, вероятно, уже имелись у общего предка всех высших растений, а присутствие C3HDZ у стрептофитовых водорослей свидетельствует о том, что данные ТФ возникли до выхода растений на сушу. Наличие ARP и YABBY у моховидных и плауновидных (ARP у Selaginellales, а YABBY у Lycopodiales) указывают на вероятную утерю этих ТФ у общего предка Polypodiophyta. Реконструкция филогении выявленных у моховидных, плауновидных и папоротниковидных WOX белков позволила предположить, что T3 клада, к которой относятся регуляторы маргинальной и пластинчатой меристем листа возникла у общего предка Polypodiophyta. Сходство в молекулярно-генетической регуляции листьев всех папоротниковидных, указывает на их вероятную гомологию. Результаты исследования представлены на трёх конференциях: 1. постер и флэш-презентация (2-минутный устный доклад) "Evolution of leaf development in land plants: a bioinformatic approach" на VII Международной научной конференции «Генетика, Геномика, Биоинформатика и Биотехнология растений» (PlantGen 23), https://plantgen2023.ofr.su/assets/files/program-plantgen2023-kazan.pdf 2. устный доклад "Интеграция структурного и биоинформатического подходов проясняет некоторые аспекты гомологии листьев в разных таксонах несеменных растений" (М.А. Романова); на XV Делегатском Съезде Русского Ботанического Общества, https://www.binran.ru/files/conferences/RBO/RBO_2023_Program.pdf 3. устный доклад "Структурные и регуляторные аспекты органогенеза Equisetidae и Polypodiidae" (М.А. Романова) на Всероссийской конференции по естественным и гуманитарным наукам с международным участием с международным участием "Наука СПбГУ 2023", По материалам материалам исследования опубликовано 2 статьи. 1. Романова М.А., Домашкина В.В., Бортникова Н.А. 2023. Структурные и регуляторные аспекты морфогенеза Equisetum sylvaticum и Equisetum fluviatile в связи с гомологией листьев хвощовых и других папоротниковидных – Бот. журн. 108 (9): 3-38. DOI: 10.31857/S0006813623090065 2. Romanova M.A., Domashkina V.V., Maksimova A.I., Pawlowski K., Voitsekhovskaja O.V. 2023. All together now: Cellular and molecular aspects of leaf development in lycophytes, ferns, and seed plants. – Front. Ecol. Evol. 11. https://doi.org/10.3389/fevo.2023.1097115