Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Созданы коллекции образцов плазмы крови клинически здоровых женщин (ЗЖ, 30 человек, средний возраст 44±4 года) и первичных больных с люминальным А подтипом рака молочной железы (РМЖ) на начальных стадиях заболевания (30 человек, средний возраст 46±5 лет, T1-2N0-2M0). Показано, что концентрация гистона Н2а в плазме крови онкологических больных достоверно выше, чем у клинически ЗЖ (критерий Манна-Уитни, р = 0,039). Поскольку гистон Н2а является частью циркулирующих в крови нуклеопротеиновых комплексов (НПК) и известно, что уровень внеклеточной ДНК (внДНК) в крови онкологических больных достоверно повышается, теоретически предсказанное повышение концентрации гистона Н2а как компонента НПК было экспериментально подтверждено. На основе активированной бромцианом сефарозы был синтезирован аффинный сорбент с иммобилизованными коммерческими антителами против гистонов Н2А, Н2В, Н3 (поликлональные кроличьи антитела производства Cloud-Clone Corp., Китай), НПК были выделены из 4 мл плазмы крови ЗЖ и больных РМЖ. Для характеризации дезоксирибонуклеиновой составляющей в составе НПК и оценки доли внДНК в составе данных комплексов, ДНК из образцов НПК и из плазмы крови ЗЖ и больных РМЖ выделили коммерческим набором «BPD-100» (ЗАО «Биосилика», Новосибирск, Россия). Концентрацию внДНК и ДНК в составе НПК определяли в образцах методом ПЦР «в режиме реального времени» на повторы L1. В плазме крови больных РМЖ обнаружено достоверное увеличение концентрации внДНК по сравнению со ЗЖ (p = 0,0026, U-критерий Манна-Уитни). Размер ДНК в плазме и в составе НПК определяли с помощью капиллярного электрофореза с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA) и набора «High Sensitivity DNA Kit». Установлено, что интегральный образец плазмы ЗЖ в основном содержал фрагменты ДНК ~180 п.н. и фрагменты 320, 540 и более 7000 п.н. в значительно меньшей степени. Преимущественно высокомолекулярная ДНК (более 2000 п.н.) была обнаружена в ДНК плазмы больных РМЖ. Концентрация ДНК в составе НПК плазмы крови ЗЖ была достоверно ниже, чем в составе НПК плазмы крови больных РМЖ (p = 0,0041, U-критерий Манна-Уитни). Показано, что в составе интегральных образцов гистон-содержащих НПК, циркулирующих в плазме крови ЗЖ и больных РМЖ преобладает ДНК длиной 150-200 п.н. Доля ДНК в составе НПК от общей внДНК в плазме крови в норме и при РМЖ достоверно не отличалась (р = 0,655, U-критерий Манна-Уитни). Концентрация белка в препаратах нативных НПК из плазмы ЗЖ и больных РМЖ была определена с помощью набора «NanoOrange Protein Quantitation kit» (Molecular Probes, USA). Показано, что доля белка в составе НПК от общего содержания белка в плазме крови в норме и при РМЖ достоверно не отличается (р = 0,521, U-критерий Манна-Уитни). С помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии с высокой достоверностью (p<0.05) в НПК крови ЗЖ и больных РМЖ идентифицированы 177 и 169 белков, соответственно, 38 белков (12%) из которых являлись универсальными (встречались как в норме, так и при развитии патологии). Сравнительный анализ белков в составе НПК в индивидуальных образцах выявил наиболее часто встречающиеся белки: доля 23 мажорных белков (встречающихся не реже, чем у 10 из 60 человек) составила 7,5%. Для выяснения функций идентифицированных белков циркулирующих НПК крови проводили анализ функционального обогащения генных онтологий с помощью программного обеспечения Cytoscape посредством приложения BinGO по молекулярным функциям, биологическим процессам и клеточным компонентам. Несмотря на то, что результаты анализа обогащения по генным онтологиям в контексте биологических процессов и молекулярных функций предоставляли детализированную и исчерпывающую картину, для сокращения анализируемого списка и удаления терминов с низким уровнем достоверности, а также перекрывающихся и избыточных терминов, перед визуализацией было использовано программное обеспечение REVIGO. Полученные списки терминов генных онтологий 46 клеточных компонентов (Cellular Components), 57 молекулярных функций (Molecular Functions) и 144 биологических процессов (Biological Processes) и соответствующих p-уровней значимости кластеризовали и визуализировали в виде тепловых карт с помощью R. Показано, что среди белков НПК крови как в норме, так и при развитии патологии широко представлены ядерные и белки органелл, а также белки-участники макромолекулярных комплексов. Уникальными для НПК крови ЗЖ являлись белки, непосредственно взаимодействующие с ДНК, а для НПК крови больных РМЖ – белки цитоскелета и белковых комплексов. Широко представленные в составе обоих протеомов НПК хроматиновые белки и белки, опосредующие матричные процессы, указывают на то, что в НПК преобладают белки, связывающие ДНК, опосредующие её транспорт и защищающие её от действия нуклеаз при циркуляции, а наличие цитоскелетных и белков-участников макромолекулярных комплексов указывает на то, что помимо ДНК-связывающих белков НПК содержат и белки-“пассажиры”, связывающиеся с комплексами через ДНК-связывающие белки и, возможно, играющие роль в защите внДНК от действия нуклеаз, узнавании комплекса иммунной системой, интернализации и клиренсе НПК. Примечательно, что такие белки-“пассажиры” характерны для НПК крови больных РМЖ, однако ими не обогащены протеомы НПК ЗЖ. Это может указывать на особенности формирования и секреции НПК, а повышение гетерогенности состава нуклеосомных комплексов в условиях развития злокачественного новообразования – на расширение их биологических функций. Анализ молекулярных функций белков в составе НПК показал, что состав циркулирующих в крови НПК как в норме, так и при развитии РМЖ обогащён белками, связывающими ДНК и белки. Уникальные белки НПК ЗЖ обогащены белками, связывающими рецепторы и осуществляющими ферментативную активность, а больных РМЖ – связывающими Wnt-активированные рецепторы, при этом известно, что канонический и неканонические сигнальные каскады Wnt воздействуют на разные этапы развития опухоли. В контексте биологических процессов показано, что универсальные белки НПК крови (т.е. характерные для ЗЖ и больных РМЖ) обогащены белками, регулирующими передачу сигнала и клеточный метаболизм (в т.ч. нуклеотидов). Уникальные белки НПК ЗЖ вовлечены в регуляцию сборки и локализацию экзоцисты, репликацию ДНК и метаболизм РНК, в то время как белки НПК крови больных РМЖ – регуляцию транскрипции и слияние с плазматической мембраной. Впервые проведенный комплексный анализ белкового состава нативных НПК расширил фундаментальные знания об участии белков в транспорте внДНК в кровотоке. Сравнительный анализ протеомов НПК крови ЗЖ и больных РМЖ позволил выявить опухолеспецифические белки, и наметить перспективные опухолевые протеомные маркеры, которые вкупе с анализом опухолеспецифической ДНК могут увеличить чувствительность и специфичность ранней диагностики опухолей методом «жидкой биопсии». Результаты работы по проекту в 2022 г были опубликованы в виде научной статьи (Diagnostics (Basel); импакт фактор 3,99), а также в виде обзора по влиянию белков на судьбу и биологическую роль внеклеточной ДНК в журнале первой категории (Int J Mol Sci.; импакт фактор 6,21). Высокая актуальность опубликованных работ подтверждается информацией с сайта Издательства MDPI: статья Diagnostics (Basel) 2022;12(4):854 опубликованная 30.03.2022 имеет на 13.12.2022 3 цитирования и 1165 прочтений; обзор Int J Mol Sci. 2022;23(13):7224 опубликованный 29.06.2022 имеет 13.12.2022 684 прочтения. Кроме того, результаты работы по проекту были представлены в виде двух устных докладов «Сравнительный протеомный анализ циркулирующих нуклеопротеиновых комплексов крови здоровых женщин и больных раком молочной железы» и «Поиск опухолевых маркеров в составе нуклеопротеиновых комплексов, циркулирующих в крови больных раком молочной железы» на конференциях «IV Всероссийская конференция с международным участием «Опухолевые маркеры: фундаментальные и клинические аспекты»» и «VII Всероссийская конференция по Молекулярной онкологии», соответственно. В соответствии с планом работ подготовлены промежуточный научный и финансовый отчеты по проекту.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 г в составе идентифицированных белков нуклеопротеиновых комплексов (НПК), циркулирующих в плазме крови здоровых женщин (ЗЖ) и больных раком молочной железы (РМЖ) с использованием QuickGO по ГО “связывание нуклеиновых кислот” (nucleic acid binding, GO:0003676) и “связывание нуклеотидов” (nucleotide binding, GO:0000166) выявлены белки, связывающие ДНК и нуклеотиды. Показано, что со связыванием нуклеиновых кислот и нуклеотидов ассоциированы 70 белков (40%) и 58 (34%) в составе НПК крови ЗЖ и больных РМЖ, соответственно. Среди универсальных белков НПК НК-связывающими были 15 (39%) белков. С помощью веб-платформы Interpro и баз данных Interpro, PROSITE, Pfam, SMARTи CDD выявлено 38 типов ДНК-связывающих мотивов, наиболее представленными среди которых являются цинковые пальцы (C2H2, CCCH, PHD, C4, CXXC и RING типов), домены Гомеобокса, KRAB, петля-поворот-петля и лейциновые застёжки. В результате проведенного аннотационного анализа и функциональной классификации ДНК-связывающих белков и белков-«пассажиров» (не связывающих ДНК) в составе НПК в зависимости от клеточной локализации и биологических процессов, в которых они участвуют с использованием биоинформационных ресурсов (FunRich, Strong Protein Network и др.) показано, что среди ДНК-связывающих белков НПК, циркулирующих в крови условно ЗЖ и больных РМЖ преобладали ядерные (61 и 69%, соответственно) и цитоплазматические белки (по 45 и 48%, соответственно). В крови больных РМЖ в составе НПК повышена представленность ДНК-связывающих белков, вовлеченных в процессы регуляции метаболизма нуклеотидов, нуклеозидов и нуклеиновых кислот (43% при раке и 34% в норме) и снижена представленность ДНК-связывающих белков, вовлеченных в процессы межклеточной коммуникации и передачи сигналов (при РМЖ по 17%, в норме 25% и 27%, соответственно). Сравнительный анализ функционального обогащения, проведенный с помощью FunRich показал, что среди белков-«пассажиров» в составе НПК, циркулирующих в крови условно ЗЖ и больных РМЖ преобладали белки цитоплазмы (по 35%), плазматической мембраны и ядра (27% и 28%, 25% и 26%, соответственно). Среди белков-«пассажиров» НПК крови в норме и при РМЖ сопоставимо представлены белки, регулирующие межклеточную коммуникацию (20% и 22%, соответственно) и передачу сигналов (23% и 24%, соответственно); представленность белков-«пассажиров» у условно ЗЖ, опосредующих энергетические пути была в три раза выше, чем у онкологических больных (16% и 5%, соответственно), а белков, вовлеченных в процессы транспорта – ниже (7% и 12%, соответственно). Таким образом, в состав НПК входят как ДНК-связывающие белки, преимущественно ядерного и цитоплазматического происхождения, так и белки-«пассажиры», имеющие цитоплазматическое и ядерное происхождение, а также плазматической мембраны. Установлено, что в процессы регуляции метаболизма нуклеотидов, нуклеозидов и нуклеиновых кислот вовлечены преимущественно ДНК-связывающие белки, а в процессы межклеточной коммуникации и передачи сигнала – белки-«пассажиры»; также обращает внимание повышение доли белков-«пассажиров» в составе НПК крови больных РМЖ, вовлеченных в неизвестные биологические процессы. По-видимому, белки-«пассажиры» связываются с комплексами через ДНК-связывающие белки и играют значимую роль в транспорте и защите внеклеточной ДНК от действия нуклеаз, узнавании комплекса иммунной системой, интернализации и клиренсе НПК. Для выявления белков, вовлеченных механизмы возникновения внеклеточной ДНК в кровотоке (апоптоз, некроз, активная секреция), протеомы НПК из крови ЗЖ и больных РМЖ анализировали с использованием QuickGO по ГО “апоптотические процессы” (apoptotic process, GO:00006915) и “некротические процессы” (necrotic process, GO:0070266) и “секреция” (secretion, GO:0046903). Показано, что с апоптозом ассоциированы 6 и 3 уникальных белка в составе НПК крови ЗЖ и больных РМЖ, соответственно. Кроме того, в НПК крови ЗЖ выявлен один белок, ассоциированный с некротическими процессами и три белка, ассоциированные с секрецией, что косвенно указывает на то, что в норме внеклеточная ДНК появляется в крови преимущественно в результате запрограммированной клеточной гибели. В составе НПК крови больных РМЖ не выявлены белки, вовлеченные в некротические процессы, однако 5 белков ассоциированы с активной секрецией, что косвенно указывает на преобладание в крови онкологических больных секретированной ДНК над апоптотической. Из 16 белков в составе НПК, ассоциированных с апоптозом, некрозом или активной секрецией, только 2 белка являлись ДНК-связывающими, что еще раз свидетельствует о высокой значимости в составе ДНК-белковых комплексов белков-«пассажиров». С использованием БД dbDEPC установлено, что 44 (34 %) уникальных белка НПК крови больных РМЖ дифференциально экспрессируются при ряде злокачественных новообразований, из них 14 белков (11%) – при РМЖ. Комбинация белков SPG7, ADRB1, SMCO4, PHF1, PSMG1 в составе НПК позволяет дифференцировать первичных больных РМЖ (T1N0M0) от условно ЗЖ с чувствительностью 100% и специфичностью 80% (AUC 0,900, 95% доверительный интервал 0,751 дo 0,975). Поскольку из пяти потенциально диагностически значимых белков только один является ДНК-связывающим белком (PHF1), вероятно, что именно белки-“пассажиры” обуславливают формирование и структуру НПК, их транспорт и последующую передачу сигналов клеткам-реципиентам. Анализ диагностически значимых белков НПК (PHF1, SPG7, ADRB1, SMCO4, PSMG1) с использованием данных, доступных в Human Protein Atlas показал, что белок PHF1 гиперэкспрессирован, а белки SMCO4 и PSMG1 имеют средний уровень экспрессии в клетках карциномы молочной железы, при этом все они обладают низкой тканеспецифичностью. Информация об уровне экспрессии белков ADRB1 и SPG7 в тканях молочной железы, их диагностической и прогностической значимости в базе данных Human Protein Atlas отсутствует. В дальнейшем выявленные уникальные для опухоле-специфических белков ДНК-связывающие мотивы могут быть использованы для обогащения внеклеточной ДНК опухолевого происхождения, что может повысить эффективность диагностики онкологических заболеваний методом «жидкостной биопсии». Выявленные перспективные протеомные маркеры РМЖ (SPG7, ADRB1, SMCO4, PHF1, PSMG1) НПК необходимо в дальнейшем верифицировать на обширных группах пациентов. Подводя итог, можно заключить, что полученные в результате выполнения проекта РНФ данные о белках, участвующих в транспорте внеклеточной ДНК в составе НПК, отвечающих за транспорт опухоле-ассоциированных нуклеиновых кислот в кровотоке, имеют принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов процессов, обеспечивающих передачу генетической информации и сигналов между клетками. Полученная информация может быть использована для создания новых методов диагностики онкологических заболеваний и создания фундаментальных предпосылок для возможной оптимизации противораковой терапии. Результаты работы по проекту РНФ в 2023 г были представлены в виде двух докладов на конференциях: • Международная конференция «Генетические технологии в трансляционной биомедицине», г. Томск, Россия. • VIII Всероссийская конференция по Молекулярной онкологии, г. Москва, Россия. В соответствии с планом работ опубликованы статьи в журналах International Journal Molecular Science (первой категории, импакт фактор 5,6) и Journal of Personalized Medicine (второй категории, импакт фактор 3,4). • Tutanov O., Shefer A., Tsentalovich Y., Tamkovich S. Comparative Analysis of Molecular Functions and Biological Role of Proteins from Cell-Free DNA-Protein Complexes Circulating in Plasma of Healthy Females and Breast Cancer Patients. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(8):7279. https://doi.org/10.3390/ijms24087279. • Shefer A., Tutanov O., Belenikin М., Tsentalovich Y., Tamkovich S. Blood plasma circulating DNA-proteins complexes: involvement in tumor dissemination and prospects for liquid biopsy of breast cancer”, Journal of Personalized Medicine 2023, принята в печать.