Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Один из самых распространенных вирусных патогенов - респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). К настоящему моменту не создано эффективных, безопасных и при этом доступных средств его лечения и профилактики. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными, поэтому в настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты. Создаются препараты на основе моноклональных антител, однако их использование будет дорогостоящим. Одним из привлекательных направлений в создании антимикробных и антивирусных препаратов является применение природных пептидов и их синтетических аналогов в качестве фармацевтических агентов. В ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России был синтетический дендримерный пептид b-LTP, который значительно подавлял репликацию РСВ. Пептидные соединения часто обладают сразу несколькими биологическими свойствами. Нашим коллективом была доказана бифункцональность пептида b-LTP, который подавляет РСВ-инфекцию, а также способен транспортировать молекулы миРНК в эпителиальные клетки респираторного тракта млекопитающих, являющихся местом локализации РСВ. Наличие у одного пептида двух биологических активностей (антивирусной и транспортной) открывает возможность для усиления его антивирусного биологического эффекта за счет образования комплекса пептида с дополнительной антивирусной молекулой миРНК. Таким образом, главной целью данной работы является исследование возможности усиления антивирусной активности бифункциональных пептидов за счет формирования комплекса с молекулами миРНК. В рамках данного этапа мы наработали пептид b-LTP и молекулы миРНК, направленные против жизненно важных генов РСВ (siN-745 и siP4). Методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии подтверждена подлинность и чистота как молекул миРНК, так и пептида. Также, показано, что пептид-носитель и молекулы миРНК при помощи электростатических сил формируют наноструктуры размером 714±125 нм, которые обладают позитивным зарядов равным 16,9 ±6,71 mV, что необходимо для его успешного проникновения внутрь клеток-мишеней и осуществления антивирусной активности. В отдельно серии экспериментов установлено, что оптимальным соотношением комплекса нуклеиновая кислота/носитель является 1/12,5 по массе. Определены цитотоксические концентрации для комплекса миРНК/пептид и его отдельных компонентов. Показано, что цитотоксичность комплекса обеспечивается присутствием в нем пептида, поскольку значения СС50 для комплекса и пептида близки. СC50 для свободного пептида на клетках ЛЭЧ составляет от 370±150 мкг/мл, а для комплекса на этой же клеточной линии 740±180 мкг/мл. СC50 для b-LTP на культуре клеток HEp-2 равна 400±10 мкг/мл, а для комплекса 510±30 мкг/мл, соответственно. Стоит также отметить, что цитотоксичность комплекса на обоих культурах клеток ниже в сравнении со свободным пептидом. По всей видимости молекулы миРНК, находящиеся в составе комплекса, частично нейтрализуют его позитивный заряд, что снижает негативный эффект пептида на мембраны клеток. При этом свободные молекулы миРНК ожидаемо не проявили цитотоксического действия на клетки. Исследование противовирусной активности показано, что происходит усиление антивирусных свойств комплекса в сравнении с свободным пептидом. Комплекс подавляет репликацию вируса в культуре клеток в 200 раз, в то время как пептид обеспечивает подавление в 23 раза. Такой усиленный антивирусный эффект комплекса достигается за счет того, что пептид b-LTP, обладая собственными антивирусными свойствами предотвращает ранние стадии инфекции (вход РСВ в клетки). Дополнительно молекулы миРНК, доставляемые пептидом b-LTP (за счет его транспортной активности) в инфицированные клетки блокирует поздние стадии жизненного цикла РСВ (репликацию генома и транскрипцию вирусных мРНК). На последующем этапе проекта мы планируем изучить активность созданного комплекса в экспериментальной модели РСВ-инфекции у мышей.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Один из самых распространенных вирусных патогенов - респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). К настоящему моменту не создано эффективных, безопасных и при этом доступных средств для лечения и профилактики симптомов, вызванных РСВ-инфекцией. В настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты. Создаются препараты на основе моноклональных антител, однако их использование предполагает быть дорогостоящим. Одним из привлекательных направлений в создании антимикробных и противовирусных препаратов является применение природных пептидов и их синтетических аналогов в качестве фармацевтических агентов. В ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России был создан синтетический дендримерный пептид LTP, который значительно подавляет репликацию РСВ. Пептидные соединения часто обладают сразу несколькими биологическими свойствами. Нашим коллективом была доказана бифункцональность пептида LTP, который подавляет РСВ-инфекцию, а также способен транспортировать молекулы миРНК в эпителиальные клетки респираторного тракта млекопитающих, являющихся местом локализации РСВ. Наличие у одного пептида двух биологических активностей (антивирусной и транспортной) открывает возможность для усиления его антивирусного биологического эффекта за счет образования комплекса пептида с дополнительной антивирусной молекулой миРНК. Таким образом, главной целью проекта является исследование возможности усиления антивирусной активности бифункциональных пептидов за счет формирования комплекса с молекулами миРНК (siN-745 и siP4), направленными против генома РСВ. Опираясь на данные о цитотоксичности и антивирусных свойствах комплекса in vitro, полученных на первом году выполнения проекта, в рамках данного этапа мы изучили антивирусную активность комплекса in vivo в эксперименте с использованием модели РСВ-инфекции у мышей. Для этого мыши самки линии BALB/с были однократно интраназально инфицированы РСВ в дозе 10^9 ТЦД50/мышь. На фоне РСВ-инфекции животным интраназально вводили исследуемый комплекс. В качестве контролей животным вводили индивидуальные компоненты комплекса (свободный пептид и миРНК) и коммерческое противовирусное средство Рибавирин. Перед проведением исследований на модели РСВ-инфекции у мышей были предварительно проведены токсикологические исследования in vivo с целью установить переносимые и летальные дозы комплекса. Максимальная переносимая доза для мышей как самцов, так и самок при однократном ингаляционном введении препарата siN+P/LTP лежит выше 10 мг/кг. Проведенные исследования на модели РСВ-инфекции у мышей показали, что интраназальное применение как свободного пептида LTP, так и его комплекса с молекулами миРНК, существенно снижает вирусную нагрузку в легких, что подтверждается количественной ПЦР. Максимальным антивирусным эффектом обладает комплекс siN+P/LTP, который снижает вирусную нагрузку в легких в 7 раз, что согласуется с ранее проведенными исследованиями in vitro. Комплекс, снижая вирусную нагрузку в легких, способствовал уменьшению воспаления респираторного тракта животных, что выражалось в существенном снижении числа провоспалительных клеток в нижних дыхательных путях мышей. Так, мы наблюдали, снижение доли бокаловидных клеток в респираторном эпителии бронхов в 1,5 раза, уменьшение общего количества клеток в инфильтрате лёгких на 30%. Вместе с тем, терапия комплексом снижает общее количество клеток в БАЛ на 39%, лимфоцитов на 45% и макрофагов на 27%. Воспаление, вызванное РСВ-инфекцией, приводит к нарушению дыхательной функции легких, что выражается в увеличении сопротивляемости бронхов. Установлено, что интраназальное введение комплекса статистически значимо снижает гиперреактивность дыхательных путей мышей на 18%, что сопоставимо с эффектом терапии коммерческим противовирусным средством. Нашим коллективом зафиксировано улучшение показателей состояния инфицированных животных в группах, в которых проводили терапию свободным пептидом и комплексом пептида с молекулами миРНК. В экспериментах in vivo подтверждены данные, полученные на in vitro модели репликации РСВ, об усилении антивирусных свойств комплекса в сравнении со свободным пептидом. Такое усиление противовирусной активности пептида достигается за счёт его способности не только оказывать собственный антивирусный эффект, но и транспортировать в инфицированные клетки миРНК, направленные против жизненно важных генов РСВ. Описанный подход к усилению антивирусной активности пептидов при помощи образования комплекса реализован впервые.