Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На данный отчетный период получены внеклеточные везикулы от трех культур глиальных клеток-предшественников (ВВ-ГКП) и выполнена их характеристика по наличию трансмембранных белков СD63, CD81 и CD9. Изучена морфология внеклеточных везикул путем проведения электронной микроскопии и их размера с применением анализа траекторий наночастиц (NTA анализ). Общая концентрация частиц для культур глиальных клеток-предшественников, полученных от трех разных доноров, варьируется незначительно 1,58-3,28*10^11 частиц/мл. Оценен мкРНКовый состав внеклеточных везикул с использованием NGS-технологий. Было идентифицировано 133 мкРНК, функциональная значимость которых направлена на предотвращение развития различных патологических состояний головного мозга, таких как отек, ишемия. Исследовано терапевтическое действие интраназального шестидневного введения ВВ-ГКП на модели черепно-мозговой травмы (модель падающего груза). Произведена оценка в изменении объема очага повреждения с помощью МРТ диагностики и неврологического статуса животных (тесты "Цилиндр", "Постановка конечности на опору", "Ротарод"). Терапия ВВ-ГКП показала значительное восстановление функций головного мозга животных, улучшая общий неврологический статус и моторные функции поврежденного полушария по сравнению с контрольной группой. При этом в экспериментальной группе не наблюдали выраженного уменьшения объема очага повреждения. Выполнено гистологическое исследование головного мозга крыс. Изучено противовоспалительное действие (выполнена количественная оценка фагоцитирующих и активированных макрофагов/микроглии по М1 или М2 фенотипу) и оценена степень глиоза головного мозга животных. Введение ВВ-ГКП способствовало снижению уровня воспаления как в области травмы за счет уменьшения количества моноцитарных макрофагов (СD68+) и увеличения количества макрофагов М2-фенотипа (CD206+), так и в области гиппокампа за счет уменьшения клеток микроглии (CD11b+). В области травмы наблюдали снижение количества астроцитов, которые потенциально могут тормозить процессы репарации аксонов и дендритов нейронов. Проведено молекулярно-генетического исследования тканей мозга и оценена экспрессия генов-маркеров апоптоза (Bax и Bcl2), воспаления (IL1b, IL6, IL10, IL12, TNFa), матричных металлопротеиназ и их ингибиторов (Mmp2, Mmp9, Timp1 и Timp2). При введении ВВ-ГКП в области травмы, гиппокампа, а также стриатума, наблюдали уменьшение экспрессии генов провоспалительных цитокинов IL6, IL12b и IL1b и только в области травмы увеличение экспрессии гена противовоспалительного цитокина IL10. Данная терапия способствовала уменьшению экспрессии гена Mmp9 на 7 сутки и гена Mmp2 на 14 сутки эксперимента в области травмы. Соотношение генов Bax/Bcl2, при котором клетки будут более чувствительны к апоптозу, было значительно ниже при введении ВВ-ГКП в области травмы и гиппокампа. Изучен уровень белков-маркеров нейродегенерации: APP, Тау-белка и его фосфорилированных форм. В группе с введением ВВ-ГКП в области стриатума и гиппокампа количество Тау-белка было выше, чем в контроле. При этом в опытной группе по сравнению с контрольной соотношение pTau(Ser396)/Tau было ниже в зоне травмы коры головного мозга и стриатума, а соотношение pTau(Thr205)/Tau ниже в стриатуме и гиппокампе. Таким образом, ВВ-ГКП способны улучшать сенсомоторную функцию животных при черепно-мозговой травме, стимулируя процессы нейровосстановления. Терапевтическое действие везикул направлено на несколько мишеней: подавление воспалительного ответа, уменьшение реактивного глиоза в области травмы, повышение пластичности мозга.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
С помощью протеомного анализа во внеклеточных везикулах (ВВ) глиальных клеток-предшественников, полученных из ИПСК, было выявлено 1357 белков. 60% идентифицированных белков принадлежат к категориям "везикулы" и "внеклеточные везикулы", что подразумевает о получении препарата, обогащенного внеклеточными везикулами. Были выявлены белки, относящиеся к компартментам «секреторные гранулы» (17% идентифицированных белков) и «секреторные везикулы» (17%). Были определены белки, относящиеся к группам «мембрана»- 69%, «белковый мембранный комплекс» - 13% и «везикулярное окаймление» - 3%. Было обнаружено 56,5% белков, относящихся к категории «цитозоль», что дает возможность предположить, что эти белки локализованы в люмине везикул. Кроме того, 53%, 15% и 5% идентифицированных белков было отнесено к категории «внеклеточный регион», «фокальная адгезия» и «внеклеточный матрикс», соответственно. Кроме того, 8%, 6,5% и 3% белков были отнесены к категориям «люмен секреторных гранул», «мембрана Гольджи» и «поздняя эндосома», соотвественно, что позволяет предположить пути образования и внутриклеточной миграции внеклеточных везикул через Аппарат Гольджи и поздний эндосомный компартмент. Согласно категории «биологические процессы» 60% проанализированных белков вовлечены в метаболические процессы, 38% - процессы развития, 27,5% - процессы иммунной системы, 25% - образование клеточных компонентов и 9% - клеточную коммуникацию. Также обнаруженные белки были отнесены к группе «окислительно-восстановительные процессы» (8% идентифицированных белков) и «ответ на снижение уровня кислорода» (6%). Более того, 9% идентифицированных белков было отнесено к группе «негативная регуляция клеточной гибели», при этом 4% белков было выделено в группу «негативная регуляция гибель нейронов». Также 2,5% белков были отнесены к категории «NIK-Nf-kappaB сигналинг», среди которых были обнаружены белки: субъединицы Nf-kappaB комплекса и активаторы NIK-Nf-kappaB сигналинга (например, DDX1). Эти данные позволяют предположить, что белки внеклеточных везикул активируют пути выживаемости клеток, а также стабилизации внутриклеточного гомеостаза. Кроме того, 8% белков было отнесено как к категории «дифференцировка нейронов», так и к «позитивная регуляция клеточной дифференцировки»; 4% белков были отнесены к группам «позитивная регуляция дифференцировки нейронов» и «позитивная регуляция развития нервной системы». Небольшая часть белков была отнесена к группе «позитивная регуляция нейрогенеза» (5%), «развитие аксонов» (4%) и «удлинение аксона» (1%). Среди белков, отвечающих за молекулярные функции, были выделены группы «связывание белков клеточной адгезии» (14%), «связывание лигазы убиквитин-подобного протеина» и «связывание лигазы белка убиквитина» (по 4%), «связывание протеаз» и «связывание шаперонов» (по 1,5%), «связывание убиквитина» и «связывание тау белка» (по 1%). Также были выделены белки с различными активностями, такие как «активность структурных молекул» (10%), «оксидредуктазная активность» (6%), «антиоксидантная активность» (1,5%) и «пероксидазная активность» (1%), что указывает на роль внеклеточных везикул в клеточной коммуникации, передаче сигнала, правильном компактизации белков и выживаемости клеток. Для оценки нейропротективного действия была выбрана модель глутаматной эксайтотоксичности. Добавление 100 мкМ глутамата приводило к снижению числа жизнеспособных кортикальных нейронов на 37,5±4,03% по сравнению с группой контроля. При этом добавление ВВ в концентрации 3 мкг/мл достоверно повышало выживаемость кортикальных нейронов на 20%±5,56% (p=0,046). Более того, присутствие ВВ с концентрацией 10 мкг/мл достоверно увеличивало количество жизнеспособных клеток до контрольных значений (p<0,001). Основным путем выживания нейронов является PI3K сигнальный путь. Для установки влияния ВВ на этот сигнальный путь был выбран ингибитор AS605240. Для этого одновременно добавляли ВВ с ингибитором AS605240 до конечной концентрации 1 мкг/мл. Благодаря полученным данным было установлено, что присутствие данного ингибитора вместе с ВВ с концентрацией (10 мкг/мл) достоверно снижало нейропротекторный эффект внеклеточных везикул до значений группы с воздействием глутаматной эксайтотоксичности. Это позволяет предположить, PI3K-Akt является основным путем выживания нейронов, активируемым ВВ. Также на данной модели был оценен уровень экспрессии генов-маркеров апоптоза, окислительного стресса и нейритогенеза. Анализ ПЦР в реальном времени показал, что воздействие глутаматной эксайтотоксичности (Глу) повышает уровень экспрессии гена Bax (позитивный регулятор апоптоза) и снижает экспрессию гена Bcl2 (негативный регулятор апоптоза) в культуре кортикальных нейронов. Инкубация ВВ с кортикальными нейронами повышала уровень экспрессии гена Bcl2 в 7,5 раз, а Bax - снижала в 25,5 раза. Также было показано, что добавление ВВ повышает уровень экспрессии генов NFE2L2 и HMOX1, связанных с антиоксидантной защитой клеток, в культуре кортикальных нейронов. Добавление ВВ значительно увеличивало экспрессию генов NFE2L2 и HMOX1 в 7,56 и 9,31 раза соответственно по сравнению с группой, обработанной глутаматом. Также была исследована относительная экспрессия генов-маркеров нейритогенеза GAP43, SYN1, TUBB3 и MAP2. Добавление ВВ увеличивало экспрессию генов GAP43, TUBB3, SYN1, MAP2 в 2; 1,6; 1,6; 3 раза, соответственно. В работе проводили оценку влияния ВВ на изменение внутриклеточного кальция и функционирование митохондрий мозжечковых нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. Измерения с помощью флуоресцентной микроскопии показали, что инкубация с ВВ в течение суток до проведения эксперимента не изменяла уровень внутриклеточного кальция в покоящихся нейронах. Добавление глутамата (100 мкМ, 15 мин) вызывало повышения уровня яркости в сомах нейронов, что свидетельствует об увеличении уровня внутриклеточного кальция и развития замедленной дерегуляции кальция как в контрольной группе, так и в группе с ВВ. Для определения динамики замедленной дерегуляции кальция используется площадь под кривой (AUC) после начала действия глутамата, поскольку она отражает процесс поступления ионов кальция в цитоплазму при активации глутаматных рецепторов. Этот параметр был достоверно выше в нейронах контрольных культур, чем в нейронах культур, которые были проинкубированы с ВВ. Также не менее важным параметром является площадь под кривой на стадии удаления ионов кальция и глутамата и инкубировании с EGTA (100 мМ) и Mg2+ (2 мМ) в течение 30 минут – стадия «отмывки». Она свидетельствует об снижении уровня свободного цитоплазматического кальция в условиях отсутствия глутамата и восстановлении гомеостаза данного иона. Удаление глутамата и ионов кальция из буфера привело к снижению уровня кальция и в контрольной, и группе с ВВ, однако параметр площади под кривой был достоверно ниже у группы с ВВ относительно контрольной группы. Последним проанализированным параметром является площадь под кривой при деполяризации мембран митохондрий под действием протонофора карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразона (FCCP, 1 мкМ). Так как митохондрии являются внутриклеточным депо кальция, при деполяризации мембраны депонированный кальций выходит в цитоплазму. Изменения сигнала Rh123 может быть вызвано либо изменением ΔΨm (снижением митохондриальной деполяризации) и захватом или отдачей зонда митохондриями, либо утечкой Rh123 из клеток. Для нивелирования этого эффекта измеряли отношение AUC Rh123 после полной деполяризации митохондрий протонофором FCCP (AUCFCCP) к AUC Rh123 в глутаматный период (AUCGlutamate(100mkM)) и в постглутаматный период (AUC-Ca2+,-Glutamate,+EGTA). Высокие концентрации глутамата вызывают кальциевую дизрегуляцию, которая происходит синхронно с сильной митохондриальной деполяризаций при глутаматной эксайтотоксичности. Добавление ВВ не вызывало падение митохондриального потенциала (ΔΨm), при этом снижало долю нейронов, в которых происходила сильная митохондриальная деполяризация.