Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном периоде нами была изучена численность фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин в дерме человека в различные возрастные периоды - от 20 недель беременности до 85 лет. Результаты показали, что в дерме человека от 20 недель беременности до 85 лет наблюдается увеличение доли фибробластов, имеющих положительную окраску на тиоредоксин. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния (р<0,001) возраста на изменение процента фибробластов дермы, положительно окрашенных на тиоредоксин. В ходе работы над проектом нами был выполнен анализ содержания фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме плодов человека и людей разного возраста. Результаты подсчетов показали, что в дерме человека от 20 недель беременности до 40 лет наблюдается увеличение доли фибробластов, имеющих положительную окраску на тиоредоксин редуктазу. Содержание в дерме фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин редуктазу не изменяется в возрастном интервале от 21 года до 60 лет с последующим резким увеличением от 61 года до 85 лет. Общая динамика изменений численности фибробластов с положительным окрашиванием на тиоредоксин редуктазу демонстрирует возрастание от внутриутробного периода до 85 лет. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния (р<0,001) возраста на изменение процента фибробластов дермы, положительно окрашенных на тиоредоксин редуктазу. Корреляционный анализ возрастных изменений тиоредоксин положительных фибробластов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме выявил наличие достоверной положительной взаимосвязи (r=0,79; p<0,05). Нами также была определена общая численность фибробластов в дерме путем подсчета количества клеток дермы на 1 кв. мм, положительно окрашенных на виментин и имеющих характерную морфологическую структуру фибробластов как клеток с овальным или веретенообразным ядром и небольшим объемом цитоплазмы, не связанных с кровеносными сосудами. Подсчеты показали, что содержание фибробластов в дерме постепенно и неуклонно снижается с возрастом. Корреляционный анализ возрастных изменений общего числа фибробластов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,85; p<0,05). Корреляционный анализ возрастных изменений общего числа фибробластов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,82; p<0,05). В ходе выполнения проекта нами была подсчитана доля фибробластов с положительной окраской на PCNA. Доля фибробластов с положительной окраской на PCNA уменьшается с возрастом. Наиболее значимое снижение численности PCNA-положительных фибробластов в дерме наблюдается до 40 лет. После достижения этого возраста число фибробластов с положительной окраской на PCNA остается примерно постоянным до 85 лет. Корреляционный анализ возрастных изменений доли фибробластов с положительной окраской на PCNA и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,61; p<0,05). Корреляционный анализ возрастных изменений доли фибробластов с положительной окраской на PCNA и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,78; p<0,05). В дерме плодов человека и людей разного возраста нами были изучены кровеносные сосуды при иммуногистохимическом окрашивании на CD31. Сосуды с положительно окрашенными эндотелиальными клетками на антиген СD31 нами были обнаружены в образцах всех возрастных групп. Интенсивность окрашивания эндотелиальных клеток на CD31 не имела возрастных изменений. Численность кровеносных сосудов в дерме неуклонно снижается с возрастом. Корреляционный анализ возрастных изменений числа кровеносных сосудов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,62; p<0,05). Корреляционный анализ возрастных изменений числа кровеносных сосудов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме также выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи (r=–0,48; p<0,05). Наша работа показала, что доля фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин или тиоредоксин редуктазу в дерме человека увеличивается от 20 недель беременности до 85 лет. Наибольший прирост процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин наблюдали в группе людей в возрастном интервале от рождения до 20 лет. Популяция фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин редуктазу от 21 года до 60 лет остается постоянной. Возрастной фактор оказывает достоверное влияние на количество тиоредоксин-позитивных фибробластов в дерме. Возрастной фактор также оказывает достоверное влияние на количество фибробластов с позитивным окрашиванием на тиоредоксин редуктазу в дерме. Общая численность фибробластов и процент PCNA-позитивных фибробластов, количество кровеносных сосудов в дерме планомерно уменьшаются от внутриутробного периода до 85 лет с наиболее существенным уменьшением до 40 лет. Таким образом, содержание тиоредоксин-позитивных фибробластов, фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин редуктазу увеличивается от внутриутробного периода до 85 лет, а общая численность и процент PCNA-позитивных фибробластов, число кровеносных сосудов неуклонно снижаются с внутриутробного периода онтогенеза. Таким образом, в интервале от внутриутробного периода до 85 лет динамика содержания тиоредоксин-позитивных фибробластов и фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин редуктазу противоположна изменениям в общем содержании фибробластов и доли PCNA-позитивных фибробластов, количеству кровеносных сосудов. При корреляционном анализе по полному массиву данных, охватывающему интервал от внутриутробного развития до 85 лет, нами были выявлены достоверные отрицательные взаимосвязи. Таким образом, изменения численности тиоредоксин-позитивных фибробластов и фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме в возрастном интервале от внутриутробного периода до 85 лет противоположно динамике общей численности и пролиферативной активности фибробластов дермы, численности кровеносных сосудов, что свидетельствует об участии этих компонентов системы тиоредоксина в возрастной регуляции численности популяции фибробластов, численности кровеносных сосудов в дерме. Можно предположить, что отсутствие изменений в содержании тиоредоксин редуктазы в возрастном интервале от 21 года до 60 лет приводит к тому, что тиоредоксин после окисления (использования) не может быть восстановлен, и соответственно, теряет свои функции, несмотря на его достаточное количество. Возможно, что именно недостаток тиоредоксин редуктазы в возрастном интервале от 21 до 60 лет лежит в основе возрастного уменьшения численности фибробластов и кровеносных сосудов в дерме человека. Руководитель проекта Гунин А.Г. принял участие в передаче на радио России-Чувашия, в которой рассказал о настоящем проекте и проводимым исследованиям по значению тиоредоксина в возрастных изменениях кожи (https://chgtrk.ru/radio/programmy/tehnoproryv/tehnoproryv-13012022). Краткие результаты исследований по проекту размещены в сети Интернет (http://histol.ru/med-news/aging.htm).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
За отчетный период работы по проекту были получены результаты по локализации и содержанию в коже человека компонента системы тиоредоксина - тиоредоксин связывающего протеина, данные о численности фибробластов (окраска гематоксилин-эозином, виментин), кровеносных сосудов (CD31), пролиферативной активности фибробластов (PCNA) в дерме в разные возрастные периоды жизни. Исследование проводили на фрагментах кожи из нижней части передней поверхности шеи, полученных при аутопсии (верхний угол стандартного разреза кожи при аутопсии) плодов человека, умерших от различных причин антенатально на сроке 20–40 недель беременности, и людей, умерших от различных причин в возрасте от рождения до 85 лет. Тиоредоксин связывающий протеин, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), виментин выявляли непрямым иммуногистохимическим методом. Далее в препаратах определяли общее число фибробластов (окраска гематоксилином и эозином, виментин), кровеносных сосудов (CD31) в дерме на 1 кв. мм ткани, процент фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин связывающий протеин и PCNA. Результаты показали, что в дерме человека доля фибробластов, имеющих положительную окраску на тиоредоксин связывающий протеин, увеличивается от 20 недель внутриутробного периода до 60 лет с последующим незначительным снижением в возрастном интервале от 61 года до 85 лет. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменение процента фибробластов дермы, положительно окрашенных на тиоредоксин связывающий протеин. Установлено, что содержание фибробластов в дерме постепенно и неуклонно снижается с возрастом. Наиболее существенное снижение численности фибробластов в дерме происходит до 40 лет. С этого возраста и до 85 лет общее число фибробластов в дерме уменьшается незначительно. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на численность фибробластов в дерме. Корреляционный анализ возрастных изменений общего числа фибробластов и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин связывающий протеин в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи. Доля фибробластов дермы у человека с положительной окраской на PCNA уменьшается с возрастом. Наиболее значимое снижение численности PCNA-положительных фибробластов в дерме наблюдается до 40 лет. После достижения этого возраста число фибробластов с положительной окраской на PCNA остается примерно постоянным до 85 лет. Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на изменения численности PCNA-положительных фибробластов в дерме. Корреляционный анализ возрастных изменений доли фибробластов с положительной окраской на PCNA и общего числа фибробластов в дерме показал наличие достоверной положительной взаимосвязи. Корреляционный анализ возрастных изменений доли фибробластов с положительной окраской на PCNA и процента фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин связывающий протеин в дерме выявил наличие достоверной отрицательной взаимосвязи. Результаты корреляционного анализа между возрастными изменениями доли фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин связывающий протеин и тиоредоксин-положительных фибробластов показали наличие достоверной положительной взаимосвязи. Корреляционный анализ между возрастными изменениями доли фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин связывающий протеин и с положительным окрашиванием на тиоредоксин редуктазу выявил наличие достоверной положительной взаимосвязи. Таким образом, изменения численности тиоредоксин-позитивных фибробластов и фибробластов с позитивной окраской на тиоредоксин редуктазу в дерме в возрастном интервале от внутриутробного периода до 85 лет противоположно динамике общей численности и пролиферативной активности фибробластов дермы, численности кровеносных сосудов, что свидетельствует об участии этих компонентов системы тиоредоксина в возрастной регуляции численности популяции фибробластов, численности кровеносных сосудов в дерме. Можно предположить, что отсутствие изменений в содержании тиоредоксин редуктазы в возрастном интервале от 21 года до 60 лет приводит к тому, что тиоредоксин после окисления (использования) не может быть восстановлен, и соответственно, теряет свои функции, несмотря на его достаточное количество. Возможно, что именно недостаток тиоредоксин редуктазы в возрастном интервале от 21 до 60 лет лежит в основе возрастного уменьшения численности фибробластов и кровеносных сосудов в дерме человека. Наша работа показала, что доля фибробластов с положительной окраской на тиоредоксин связывающий протеин в дерме человека увеличивается от 20 нед беременности до 60 лет с последующим незначительным снижением в возрастном промежутке от 61года до 85 лет. Возрастное изменение численности фибробластов с позитивным окрашиванием на тиоредоксин связывающий протеин статистически связано с возрастными изменениями общего числа фибробластов и их пролиферативной активностью в дерме человека. Полученные нами данные также свидетельствуют о наличии дисбаланса между компонентами системы тиоредоксина в фибробластах дермы, что возможно и оказывает негативное влияние на поддержание их популяции с течением возраста. За отчетный период были проведены эксперименты на мышах. Было использовано 3 группы мышей: интактные мыши в возрасте 1,5 месяцев, интактные мыши в возрасте 5,5 месяцев, мыши, которые с 1,5-х месячного возраста до 5,5 месячного возраста получали с питьевой дорой прекурсор НАД – никотинамид рибозид (100 мг на 1 литр питьевой воды). Срезы кожи были окрашены гематоксилин-эозином, проведены иммуногистохимические реакции на тиоредоксин, тиоредоксин редуктазу, тиоредоксин связывающий протеин, пролиферативный маркер Ki-67, маркер эндотелия CD31. Проведено секвенирование РНК для определения содержания мРНК Ki-67, CD31, виментина, тиоредоксина, тиоредоксин связывающего протеина, тиоредоксин редуктазы. Результаты данных по экспериментам на мышах показали, что в коже у мышей, также, как и в коже человека, наблюдался возрастной дисбаланс в содержании компонентов системы тиоредоксина. Комплекс возрастных изменений в содержании компонентов системы тиоредоксина у мышей приводит к нарушению функциональной активности данной системы, что возможно способствует уменьшению численности фибробластов и кровеносных сосудов, угнетению пролиферации фибробластов в дерме. Никотинамид рибозид частично нивелировал возрастные изменения в дисбалансе системы тиоредоксина в коже мышей, что способствовало возрастанию пролиферации и численности фибробластов, численности кровеносных сосудов в дерме. Результаты, полученные на человеке и лабораторных животных, свидетельствуют, что в фибробластах дермы происходит возрастное уменьшение активности системы тиоредоксина. Результаты также показывают, что система тиоредоксина принимает участие в возрастной регуляции численности фибробластов и кровеносных сосудов в дерме.