Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно плану исследования был поставлен ряд экспериментов с имплантацией первичного костного мозга, полученного от мышей нескольких инбредных линий под капсулу почки алло-, изо- и сингенных мышей-реципиентов. В трех независимых экспериментах были посажены гибридные очаги (n = 20) из смеси первичного костного мозга мышей-самок линий В10.GFP и CBF1 в пропорции 1:1 в мышей-самок линии CBF1. В каждом из этих трех экспериментов показано, что очаги формируются (15/20 очагов выросло), но ни в одном из них не удалось детектировать GFP+ клетки. Отсутствие GFP+ клеток в большинстве экспериментов с гибридными очагами заставило нас перейти от посадки очагов из первичного костного мозга к модели ДККМ. При посадке гибридных очагов напрямую из костного мозга сложно равномерно перемешать костный мозг и соблюсти пропорции. Получение гибридных ДККМ избавляло нас от этих недостатков. Это позволяло добиться равномерного распределения клеток от обеих линий в культуральном флаконе и давало в руки инструмент управления соотношением сингенных и аллогенных для будущего реципиента клеток, что давало надежду на идентификацию иммунопривилегированных GFP+ клеток. В ходе выполнения проекта были получены длительные культуры костного мозга декстеровского типа (ДККМ) от мышей линий Nes-GFP, B10.GFP и CBF1 (F1 C57Black/6J x CBA). Через 2-4 недели стромальные подслои ДККМ были имплантированы под капсулу почки сингенным или аллогенным мышам-реципиентам в различных комбинациях для формирования очагов эктопического кроветворения и последующей оценки присутствия в них аллогенных клеток, экспрессирующих GFP, с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии (МПЦ). В одном из этих экспериментов было посажено 7 гибридных ДККМ из смеси костного мозга мышей-самок линий CBF1 и B10.GFP и 2 контрольные ДККМ из костного мозга мышей-самок линии CBF1. Соотношение костного мозга в гибридных ДККМ было различным: в каждую такую ДККМ одновременно сажали 2 эквивалента бедра CBF1 + 0.5 (n = 3), 1 (n = 2), 2 (n = 2) эквивалента бедра В10.GFP. Через 21 день стромальный подслой каждой ДККМ имплантировали под капсулу почку мышей-самок линии CBF1. Через 43 дня в реципиентах оценивали наличие очагов эктопического кроветворения и присутствие GFP+CD45+ и GFP+CD45- клеток в них с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии. Получены противоречивые результаты. Контрольные очаги (n = 2) выросли, а также выросли некоторые (3 из 7) гибридные очаги. Во всех трех гибридных очагах наблюдались единичные GFP+ клетки в количестве <10. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из этих очагов подтвердил результаты МЦП: во всех трех случаях были детектированы единичные Gfp+ события, частота которых была на порядок больше той, которая была определена с помощью МПЦ. Стоит, однако, заметить, что в случае генетического анализа в рассмотрение берется вся ДНК образца, включая ДНК-фрагменты от мертвых клеток, поэтому результаты подобных анализов могут давать завышенные показатели, и к ним следует относиться с осторожностью. Основные результаты проекта в 2022 годы были получены при посадке очагов с использованием линии мышей Nes-GFP в мышей изогенной линии C57Black/6J. Основной эксперимент по посадке очагов эктопического кроветворения из первичного костного мозга был выполнен на мышах линии Nes-GFP, которые являлись гибридами первого поколения от скрещивания линий Nestin-GFP и C57Black/6J. В линии Nestin-GFP ген, кодирующий белок eGFP, поставлен под контроль промотора гена Nes. Костный мозг мышей линии Nes-GFP имплантировали мышам C57Black/6J дикого типа (WT) (n = 18). Эти трансплантации считались изогенными, поскольку бэкграунд исходной линии Nestin-GFP был C57Black/6J. Часть первичных очагов, образовавшихся у изогенных реципиентов C57Black/6J (n = 7), ретрансплантировали вторичным реципиентам Nes-GFP (n = 7) (далее — изогенные ретрансплантации). Через 42 дня после процедуры посадки очаги извлекали, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), подсчитывали клетки в гематологическом анализаторе, лизировали эритроциты, а оставшиеся клетки красили с моноклональными антителами к CD45, меченными APC. Анализ проводили на проточном цитометре. Все очаги имели костную раковину, которая визуально не отличалась от сингенных контролей. Клеточность очагов не отличалась от клеточности контрольных сингенных очагов (данные не представлены). В основном эксперименте с посадкой очагов эктопического кроветворения из первичного костного мозга мышей линии Nes-GFP, первичные очаги эктопического кроветворения были обнаружены в 94% случаев (n = 17/18 очага у 9 реципиентов) через 42 дня после имплантации Nes-GFP костного мозга под капсулу почки особей дикого типа. Анализ МПЦ показал, что 7/8 первичных изогенных очагов удовлетворяли критериям включения. Точно так же очаги формировались в 100% случаев после сингенных трансплантаций Nestin-GFP (n = 8), и четыре из них соответствовали критериям включения. Каждый включенный очаг имел нормальную костную раковину. Наличие клеток GFP+ как в субпопуляциях клеток CD45–, так и в субпопуляциях CD45+ было подтверждено в 6/7 изогенных трансплантациях с использованием МПЦ. Клетки GFP+CD45– и GFP+CD45+ были обнаружены в каждом очаге сингенных трансплантаций. Интересно, что количество клеток CD45+GFP+ было сравнимо или даже превышало количество клеток GFP+CD45–. Клетки GFP+ не были обнаружены в отрицательном контроле. Средняя доля клеток GFP+ составила 4,8 × 10^(–5) ×÷10 и 21 × 10^(–5) ×÷6 при изогенной и сингенной трансплантации соответственно. Средняя доля клеток GFP+CD45– составила 2,0 × 10^(–5) ×÷9 и 1,7 × 10^(–5) ×÷3 в изогенных и сингенных трансплантациях соответственно. Средняя доля клеток GFP+CD45+ составила 2,3 × 10^(–5) ×÷10 и 17,5 × 10^(–5) ×÷7 в изогенных и сингенных трансплантациях соответственно. Ретрансплантация трансгенных первичных очагов вторичным реципиентам Nestin-GFP была успешной после длительного воздействия нативной иммунной системы. Результаты МПЦ продемонстрировали наличие GFP+CD45+ и GFP+CD45- клеток во вторичных очагах в количествах, которые были аналогичны таким количествам для нативного Nestin-GFP костного мозга или сингенной ретрансплантации. В частности, доля клеток GFP+CD45– и GFP+CD45+ составила 6,7 × 10^(–5) ×÷2,2 и 118 × 10^(–5) ×÷1,6 в изогенных ретрансплантациях. Из этих экспериментов мы заключаем, что МСК костного мозга обладают иммунными привилегиями in vivo, по крайней мере, у мышей линии C57Black/6J в условиях эктопических очагов кроветворения. Итак, МСК костного мозга, стволовые клетки мышц, волосяных фолликулов, а также кроветворные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки различного эмбриогенного происхождения, способные ускользать от иммунитета. Поскольку такие клетки можно выделить практически из любого органа и ткани, иммунные привилегии могут распространяться по всему телу млекопитающих. Результаты этого исследования подтверждают идею о том, что иммунные привилегии являются общим качеством покоящихся стволовых клеток. Распознавание МСК как клеток с иммунными привилегиями может дополнительно усилить их использование для доставки генов и улучшения приживления аллогенных трансплантатов. Наше исследование подчеркивает, что целостность ниши, а также дополнительные клетки играют роль в доступности и поддержании иммунных привилегий. Мы предполагаем существование связи между экспрессией нестина и иммунными привилегиями, основываясь на синтезе этого исследования и других. Это исследование предлагает модель и новый взгляд на линию мышей Nestin-GFP для изучения иммунных привилегий широкого спектра стволовых/прогениторных клеток во взрослом организме млекопитающих и взаимодействия стромы костного мозга в целом и МСК, в частности, с иммунной системой in vivo в условиях, близких к нативным. Этот подход можно легко распространить на другие линии мышей путем скрещивания мышей Nestin-GFP с интересующей линией и имплантации F1 костного мозга в родительскую нетрансгенную линию. Основные результаты опубликованы в статье, которая находится в свободном доступе на сайте: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcell.2022.993056/full

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В текущем отчетном периоде был завершен эксперимент с очагами эктопического кроветворения в мышах-реципиентах, предварительно иммунизированных против GFP. Эффективность и специфичность иммунизации мышей была подтверждена с помощью иммуноферментного анализа. Под капсулу каждой почки иммунизированных мышей имплантировали костный мозг от мышей линии Nes-GFP (F1 от C57Bl/6 x Nestin-GFP). Суммарно было посажено 12 очагов из костного мозга Nes-GFP в мышах-реципиентах, иммунизированных 20 мкг GFP, 4 очага в мышах-реципиентах, иммунизированных 200 мкг GFP. Отрицательным контролем служили очаги, посаженные из С57Bl/6 костного мозга, в иммунизированных GFP и БСА мышей-реципиентов линии C57Bl/6, поскольку ни доноры, ни реципиенты не несли в своем геноме GFP. Через 42 дня после имплантации оценивали наличие очага эктопического кроветворения, его клеточность («размер») и наличие в нем CD45–GFP+ и CD45+GFP+ клеток и делали вывод о наличии и силе иммунных привилегий мезенхимных стволовых клеток (МСК) и других клеточных субпопуляций костного мозга мышей. Некоторые из сформированных первичных очагов, полученных в реципиентах, иммунизированных GFP, были ретрансплантированы в нетрансгенных и неиммунизированных мышей линии С57Bl/6. Как и для первичных очагов, через 42 дня после ретрансплантации оценивали наличие очага эктопического кроветворения, его клеточность («размер») и наличие в нем CD45–GFP+ и CD45+GFP+ клеток и делали вывод о сохранении функциональности МСК. Очаги у иммунизированных реципиентов успешно сформировались в 75% случаев изогенных трансплантаций (12/16) и в 86% (6/7) случаев сингенных нетрансгенных трансплантаций. Поскольку метод формирования эктопических очагов на экстрамедуллярных участках сам по себе характеризуется эффективностью менее 100%, мы предполагаем, что различие между группами в данном эксперименте случайно и может быть объяснено неудачным хирургическим вмешательством. Мы ретрансплантировали несколько очагов неиммунизированным реципиентам, и в результате этих изогенных ретрансплантаций успешно сформировались вторичные очаги, что означает, что Nestin-GFP+ МСК могут выполнять свою функцию после специфического взаимодействия с селективно активированной иммунной системой. Первичные очаги, сформированные в иммунизированных реципиентах, характеризовались наличием костной раковины. Формальный анализ не выявил статистически значимых различий (Student’s t-test, p = 0.7) между группами «изогенная трансплантация» и «сингенная нетрансгенная транспантация» в иммунизированных реципиентах. CD45– клетки, экспрессирующие GFP, были обнаружены во внутреннем содержимом очагов при изогенных трансплантациях. Это означает, что МСК и другие клетки с данным иммунофенотипом могут выживать под действием избирательно активированной против них иммунной системы, то есть обладают сильными иммунными привилегиями. Доля клеток Nes-GFP+CD45– не зависела от дозы иммунизации GFP (p = 0,80). Формирование очагов указывает не только на выживаемость, но и на нормальное функционирование МСК, несмотря на иммунное давление. Кроме того, мы обнаружили GFP+СD45+ клетки при изогенных трансплантациях у иммунизированных реципиентов. Таким образом, мы демонстрируем сильные иммунные привилегии дополнительных субпопуляций клеток в КМ. Природа этих клеток требует дальнейшего изучения. Интересно, что доля GFP+СD45+ клеток была ниже в очагах, полученных у мышей, иммунизированных более высокой дозой GFP, по сравнению с более низкой дозой GFP (p = 0,0005). GFP+СD45+ клетки обнаруживались также в ретрансплантированных вторичных очагах. В работы был частично охарактеризован поверхностный иммунофенотип иммунопривилегированных Nes-GFP+СD45+ и Nes-GFP+CD45– клеток с помощью окрашивания моноклональными антителами против поверхностных маркеров кроветворных клеток (Lin, CD45, CD11b, CD48, CD150, CD3, Sca1) и маркеров некроветворных клеток (CD31, CD140a, CD51). Показано, что большинство иммунопривилегированных GFP+CD45+ клеток экспрессируют макрофагальный маркер CD11b, а также, что существенная доля (до 50%) этих клеток экспрессирует CD150, CD48 или Sca-1. Что касается субпопуляций GFP+CD45- иммунопривилегированных клеток, то значительная их доля экспрессирует Sca-1, а также среди них наблюдаются до 10% CD31+, CD11b+, CD150+ клеток и очень мало CD48+ клеток. Таким образом, интересный вывод из этой части работы заключается в том, что для CD45+ и CD45- иммунопривилегированных клеток костного мозга характерна экспрессия Sca-1. Мы отсортировали 4 клеточные субпопуляции (CD45+GFP-, CD45-GFP-, CD45+GFP+ и CD45-GFP+) из очагов, полученных в иммунизированных реципиентах, и проанализировали экспрессию генов в этих клетках, но полученные нами результаты требуют дополнительной проверки. В работе также использовались гибридные очаги, когда под капсулу почки мыши-реципиента (линии B10) имплантировали смесь костного мозга от мышей-доноров двух линий (B10 и B10.GFP). Гибридные очаги успешно сформировались в 6/10 случаев, в группе положительного контроля сформировались 2/4 очагов, а в группе отрицательного контроля – 4/4. Не было выявлено статистически значимых отличий клеточности гибридных очагов (медиана 1,1 × 106, диапазон 0,1-3,7 × 106 клеток в очаге) от контрольных сингенных очагов в В10 мышах (медиана 2,0 × 106, диапазон 1,1-2,9 × 106 клеток в очаге). Пять очагов было использовано для оценки содержания GFP+ клеток с помощью МПЦ. CD45+GFP+ и CD45-GFP+ клетки наблюдали в 5/5 и 4/5 гибридных очагов, соответственно. В КМ всех мышей-реципиентов гибридных очагов наблюдали CD45+GFP+ клетки. Изучение клеток КМ от трансгенного донора показало наличие GFP- клеток. Эти эксперименты показывают возможность формирования гибридных очагов. Наличие GFP- клеток в КМ B10.GFP не позволяет исключить возможность наличия таких трансгенных GFP- клеток в очаге и их вклада в формирование GFP+ популяции. Мы также отмечаем миграцию трансгенных клеток донора в КМ реципиента, где мы детектируем GFP+ CD45+ клетки. Как итог, мы дополнили список моделей, в которых демонстрируются иммунные привилегии клеток в КМ. Представленные результаты создают основу для дальнейших исследований с использованием гибридной схемы посадки. Исходный план работ был расширен. Учитывая полученные результаты о тесном взаимодействии иммунной системы, в том числе воспаления и врожденного иммунитета, и стволовой системы, мы продолжили эксперименты, связанные с прояснением роли факторов воспаления, в частности, фактора некроза опухолей альфа (ФНО, TNFa), на стволовые клетки и их потомки, в частности, на МСК и индуцибельные клетки-предшественники на модели очагов эктопического кроветворения у мышей. Мы заключаем, что TNFα – ещё один фактор воспаления, вероятно, опосредованно влияющий на функцию стромальных клеток-предшественниц костного мозга, в том числе МСК. Его предварительное введение мышам восстанавливает способность формировать такие очаги в организме мышей-реципиентов, которая без введения TNFα утрачивается или сильно снижается вследствие серийных заборов периферической крови. В рамках выполнения проекта была проведена теоретическая работа по анализу научной литературы с целью выявления взаиморегуляция иммунной системы и системы стволовых клеток различных органов и тканей взрослого организма млекопитающих, поиска общих черт этих клеток и переосмысления концепции стволовых клеток и их функции и роли в организме. Результатом этой работы стала статья, в которой приводится подробный обзор иммунных привилегий стволовых клеток, вводится термин «стволовая система» и обсуждаются вопросы взаиморегуляции иммунной и стволовой систем. По результатам этой работы опубликована статья, которая находится в бесплатном открытом доступе для всех желающих. Статью можно сказать по адресу: https://link.springer.com/article/10.1134/S0006297923110123?utm_source=rct_congratemailt&utm_medium=email&utm_campaign=oa_20231130&utm_content=10.1134/S0006297923110123