Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Молекулярный механизм БП остается неизвестным. Выявлены две самые распространённые формы БП с известной этиологией - БП, ассоциированная с мутациями в гене GBA, и БП, ассоциированная с мутациями в гене LRRK2. Лекарственных нейропротекторных препаратов при GBA-БП и LRRK2-БП на сегодняшний день не существует. последние данные указывают о возможном функциональном взаимодействии между ферментом GCase и ферментом лейцин богатой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), который кодируется геном LRRK2. Как было упомянуто выше, разработка терапевтических подходов как для лечения нейрональных форм БГ, так и для GBA-БП основана на увеличении ферментативной активности GCase (Rocha et al., 2015). Недавно было показано, что мутации, а также некоторые варианты гена LRRK2 приводят к изменению киназной активности LRRK2 и к снижению активности GCase (Ysselstein D et al., 2019, doi:10.1038/s41467-019-13413-w). Мы предполагаем, что ингибирование киназной активности LRRK2 может приводить к снижению уровня фосфорилированной формы белка Rab10, что, в свою очередь, может влиять на Rab-связанный эндолизосомный мембранный трафик, как следствие может это приводить к улучшению транспорта GCase в лизосому, увеличению активности GCase, изменению уровня аутофагии и, как следствие, снижению уровня белка альфа-синуклеина. В данном проекте был выполнен скрининг аллельных вариантов гена LRRK2 ранее ассоциированных ранее с изменением уровня фосфорилированного белка Rab10 (Rab10Trh73) (ARM (E334K, A419V, N551K), ANK (R767H), LRR (R981K, R1067Q), LRR и ROC (R1325Q), ROC (N1437H, R1441G/C/H/S, A1442P, V1447M, R1398H), COR (Y1699C, R1728H/L, S1761R, L1795F, M1646T, R1628P), kinase (G2019S, I2020T, T2031S, N2081D) and WD40 (G2385R) методом секвенирования по Сенгеру гена LRRK2 на приборе Нанофор-05 (Синтол, Россия) в группе пациентов с БП и контроле. Нами впервые было показано, варианты p.M1646T и p.N2018D ассоциированы с риском БП для российской популяции (ОШ = 2.89, ДИ 95%: 1.39-5.99, р = 0.004; ОШ = 2.35, 95% ДИ: 1.33-4.14, р = 0,003 соответственно). Варианты p.E334K, p.A419V, p.N551K, p.R1398H не были ассоциированы с БП в российской популяции (p>0,05). Варианты p.R981K, p.R1067Q, p.R1325Q, p.A1442P, p.V1447M, p.R1628P, p.G2385R гена LRRK2 являются крайне редкими для российской популяции и выявлены только у единичных пациентов с БП или контроля. Варианты R767H, N1437H, R1728H/L, S1761R, L1795F, T2031S гена LRRK2 не представлены в российской когорте пациентов с БП и в контроле. Методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) оценена активность лизосомных ферментов (глюкоцереброзидазы (GCase), альфа-галактозидазы (GLA), альфа-глюкозидазы (GAA), галактоцереброзидазы (GALC), сфингомиелиназы (ASM) и альфа-идуронидазы (IDUA)) и соответствующих субстратов лизосфинголипидов (гексазилсфингозина (HexSph) (смесь гликозилсфингозина (GlcSph) и галактозилсфингозина (GalSph)), будет оценена совместно с концентрацией лизосфингомиелина (LysoSM), лизоглоботриаозилсфингозина (LysoGb3) в группе пациентов с БП и контроле, являющихся носителямиаллельных вариантов гена LRRK2 ранее ассоциированных ранее с изменением уровня фосфорилированного белка Rab10 (Rab10Trh73). Активность фермента ASMase была снижена у пациентов p.G2019S LRRK2-БП по сравнению с пациентами с БП (p = 0,014), а среди пациентов с БП, являющихся носителями вариантов p.N2081D и p.N551K, наблюдалась тенденция к снижению активности ASMase. Активность GALC была повышена при БП по сравнению с контролем (p = 0,025). Концентрация LysoSM была снижена при БП по сравнению с контролем (p=0,0146). В то время как концентрация LysoGb3 была повышена у пациентов с БП, являющихся носителями вариантов p.G2019S и p.N2081D, по сравнению с пациентами с БП и контролем (p.G2019S: p = 0,00086, p = 0,0004 соответственно; p.N2081D: p = 0,012, p = 0,0076 соответственно). Среди индивидуумов контрольной группы носители p.N551K, p.R1398H, p.K1423K, p.N551K-p.R1398H-p.K1423K характеризовались пониженной активностью GCase, ASMase и повышенным уровнем субстрата LysoSM (p<0,05). Также для неврологически здоровых носителей варианта p.N2081D характерно снижение активности GALC и LysoGb3 (p<0,05) по сравнению с БП и контролем и тенденция к снижению активности ASMase (p=0,089) по сравнению с БП, а носительство варианта p.M1646T среди контроля ассоциировалось со снижением активности GALC по сравнению с БП и контролем (p<0,05). Также нами был проведен множественный регрессионный анализ с поправкой на пол и на возраст. По результатам регрессионного анализа было подтверждено, что носительство варианта LRRK2 p.G2019S было связано со сниженной активностью ASMase у пациентов с БП (β=-2,55, p=0,015), однако эта ассоциация не наблюдалась среди носителей варианта LRRK2 p.N2081D в группе пациентов с БП (β = -2,10, p = 0,08). Кроме того, было подтверждено влияние p.G2019S и p.N2081D на концентрацию LysoGb3 (β=0,65, p=0,006; β=0,67, p=0,01 соответственно), а также показано влияние p.N2081D на концентрацию HexSph при БП (β=2,64, р=0,01). ). В контроле выявлено, что варианты LRRK2 p.K1423K и p.R1398H были связаны с повышением уровня LysoSM, а p.N551K был положительно ассоциирован с концентрацией LysoGb3. Кроме того, в анализ был включен один пациента с БП с мутациями как в гене LRRK2 (p.G2019S), так и в гене GBA (p.N370S) (G2019S-N370S-БП). Активность ферментов и концентрацию субстратов определяли в крови в трехкратной повторности. Мы обнаружили снижение активности GCase и увеличение концентрации HexSph в G2019S-N370S-PD (p<0,0001), более того, пациент G2019S-N370S-БП характеризовался снижением активности ASMase наряду с повышенной активностью GALC и GLA и концентрацией ее субстрата LysoGb3 по сравнению с БП и контролем (p<0,05). Таким образом, впервые нами было показано, что носители вариантов гена LRRK2, ассоциированные с киназной активностью и с увеличением уровня фосфорилированного белка Rab10 (Rab10Trh73) характеризуются снижением активности ASMase и накоплением субстрата LysoGb3 к крови. В ходе культивирования первичной культуры макрофагов полученных путем выделения мононуклеарной фракции из периферической крови с последующим культивированием в присутствии колоние -стимулирующего фактора роста макрофагов (M-CSF) пациентов с LRRK2-БП, GBA-БП и контрольной группы в присутствии селективного ингибитора киназной активности LRRK2, MLi-2 в конечной концентрации 100нМ, было показано, что активность GCase увеличивается в 2.20 и в 2.26 раза соответственно по сравнению с культивированием без ингибитора, что соответствует ранее опубликованным исследованиям (Ysselstein D et al., 2019, doi:10.1038/s41467-019-13413-w). В то же время, мы впервые в группе пациентов с LRRK2-БП и пациентов с GBA-БП показали увеличение активностей ферментов GALC в 3.47 и 2.04 раза соответственно, GAA в 1.3 и 1.4 раза соответственно, GLA в 2.3 и 1.86 раза соответственно, IDUA в 3.46 и в 1.68 раз соответственно (Усенко и др., 2022, Мед. Генетика (в печати)). Нами так же впервые было показано снижение концентрации LysoGb3 в 2.2 раза при культивировании первичной культуры макрофагов пациентов с LRRK2-БП и снижение концентрации HexSph более чем в 1.5 раза при культивировании первичной культуры макрофагов пациентов с LRRK2-БП и GBA-БП в присутствии ингибитора MLi-2 по сравнению с культивированием без ингибитора. В целом проведенное исследование настоящего этапа подтвердило влияние ингибирования активности LRRK2 увеличение активности GCase. Однако, наши результаты позволяют предположить роль LRRK2 в регуляции не только активности GCase, но и других лизосомных ферментов, а также на уровень лизосфинголипидов, таких как LysoGb3, что расширяет представление о функциях LRRK2 и о возможной роли LRRK2 в патогенезе БП и расширяет представления о возможных мишенях для разработки таргетной терапии при БП. Сделано предположение, что LRRK2 может влиять не только на активность GCase, но и на лизосомные ферменты через фосфорилирование белка через Rab10.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Болезнь Паркинсона (БП) – одно из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, характеризующееся гибелью дофаминергических нейронов в черной субстанции головного мозга. В основе патогенеза БП лежит накопление и агрегация белка альфа-синуклеина. Молекулярный механизм БП остается неизвестным. Выявлены две самые распространённые формы БП с известной этиологией - БП, ассоциированная с мутациями в гене GBA1 (GBA1-БП) и с мутациями в гене LRRK2 (LRRK2-БП). Лекарственных нейропротекторных препаратов при GBA1-БП и LRRK2-БП на сегодняшний день не существует. Последние данные указывают о возможном функциональном взаимодействии между ферментом GCase и ферментом лейцин богатой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), который кодируется геном LRRK2. В отчетном периоде методом ранее разработанного нами скрининга был идентифицирован бессимптомный носитель двойной мутации в генах p.N370S/GBA1 и p.G2019S/LRRK2 в контрольной группе. В результате нами был проведен сравнительный анализ активности лизосомных ферментов и концентрации лизосфинголипидов у пациента p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-БП, выявленного в отчетном периоде за 2022 год и p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-носителя. Описана клиническая картина p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-БП. Показано, что для пациента с p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-БП характерно развитие когнитивных дефицитов, по степени тяжести сходных с наблюдаемыми у пациентов GBA1-БП. Однако продолжительность заболевания была вдвое больше, чем в соответствующей группе с GBA1-БП (24 года против 12 лет), что говорит о замедленной прогрессии заболевания и о возможном проективном эффекте LRRK2. Также у пациента p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-БП по сравнению с носителем p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2 обнаружено повышение концентрации LysoSM и снижение активности ASMase. Выраженное изменение концентрации LysoSM, наблюдаемое у p.N370S/GBA1-p.G2019S/LRRK2-БП, не было связано с клиническим течением БП. В исследование вошли единичные случаи, поэтому необходимы исследования на расширенных когортах. Однако, данные результаты были получены впервые и важны для дальнейших исследований (Usenko et al., 2023, JIN, accepted). В ходе культивирования первичной культуры макрофагов полученных путем выделения мононуклеарной фракции из периферической крови с последующим культивированием в присутствии колоние-стимулирующего фактора роста макрофагов (M-CSF) расширенных группах пациентов с LRRK2-БП, GBA-БП и контрольной группы в присутствии и без селективного ингибитора киназной активности LRRK2, MLi-2 в конечной концентрации 100нМ, было впервые показано, что колокализация GCase с лизосомой, которая была определена методом конфокальной микроскопией, снижена в первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с LRRK2-БП и GBA1-БП по сравнению с контрольной группой при культивировании без ингибитора (p<0.01). Однако, ингибитор киназной активности LRRK2 приводил к увеличению степени транслокации GCase в лизосому LRRK2-БП, GBA-БП по сравнению с макрофагами, культивируемыми без ингибитора (p<10e-7). При сопоставлении степени транслокации GCase с лизосомой в первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с LRRK2-БП и GBA1-БП, культивируемых в присутствии ингибитора киназной активности LRRK2 по сравнению с контролем нами было выявлено увеличение транслокации в группе пациентов с LRRK2-БП и GBA1-БП, но в группе пациентов с GBA1-БП данное значение было сопоставимо со значением в макрофагах контрольной группы, культивируемых без ингибитора MLi-2. Первичная культура макрофагов периферической крови пациентов с GBA1-БП характеризовалась также увеличением уровня белка GCase, определенным методом вестер-блоттинга, на фоне снижения активности GCase по сравнению с контролем (p=0.03, p=0.0074, соответственно). Более того ингибитор MLi-2 приводил к увеличению активности GCase в первичной культуре макрофагов пациентов с GBA1-БП по сравнению с макрофагами пациентов с GBA1-БП, культивируемыми без ингибитора MLi-2. Проведенное исследование в текущем отчетном периоду подтвердило влияние ингибирования активности LRRK2 увеличение активности GCase, уровень GCase, а также на транспорт GCase в лизосому и данное действие более выражено в отношении первичной культуры макрофагов пациентов с GBA1-БП. Более того был показан повышенный уровень белка LC3-II, определенным методом вестерн-блоттинга, который свидетельствует об активации аутофагии на этапе формирования аутофагосомы у пациентов с GBA1-БП по сравнению с контролем и пациентами с LRRK2-БП. Ингибирование активности LRRK2 приводило к восстановлению уровня LC3-II в первичной культуре макрофагов пациентов с GBA1-БП до значений, наблюдаемых в контроле при культивировании без ингибитора MLi-2. При оценке активности других лизосомных ферментов, которые вовлечены в сфинголипидный метаболизм, методом методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) нами было впервые показано статистически значимое снижение активности фермента GALC в первичной культуре макрофагов пациентов с LRRK2-БП по сравнению с контролем и пациентами с GBA1-БП. Ингибирование киназной активности приводило к увеличению активности фермента GALC в первичной культуре макрофагов пациентов с LRRK2-БП до значений, наблюдаемых в контроле. Также нами впервые были оценены концентрации лизосфинголипидов в первичной культуре макрофагов периферической крови в группе пациентов с LRRK2-БП и показано увеличение концентрации LysoGb3 (p=2.5e-05, p=0.0018, соответственно), LysoSM (p=0.024, p=0.048, соответственно) по сравнению с GBA1-БП и контролем, а также увеличение концентрации HexSph в группе пациентов с LRRK2-БП и пациентов с GBA1-БП по сравнению с контролем (p=0.0031, p=0.0066, соответственно). Ингибирование киназной активности LRRK2 приводило снижению концентрации субстратов и более выраженное в группе пациентов с LRRK2-БП. В частности уровень концентрации LysoSM был достоверно снижен в группе пациентов с LRRK2-БП при культивировании первичной культуры макрофагов в присутствии ингибитора MLi-2 по сравнению с макрофагами, культивированными без ингибитора MLi-2 (p=0.045). При сравнении уровня лизосфинголипидов в макрофагах группа пациентов с LRRK2-БП в присутствии ингибитора MLi-2 было выявлено снижение концентрации до уровня значений в контроле при культивировании без ингибитора MLi-2. Определена оптимальная конечная концентрация ингибитора MLi-2 для культивирования клеточной линии нейроблатомы SH-SY5Y, которая составляет 100 нМ. Показано, что MLi-2 увеличивает активность лизосомных ферментов, однако сочетанное действие селективного ингибитора GCase (CBE)+MLi-2 не приводит к увеличению активности исследуемых ферментов, в частности GCase, возможно из-за высокой концентрации селективного ингибитора GCase CBE. Более того, нами было оценено дозозависимое влияние MLi-2 на уровень GCase, аутофагию (а именно уровень белка LC3) и уровень белка альфа-синуклеина. Показано, что концентрация MLi-2 100нМ приводит к достоверному увеличению белка GCase. Также впервые было показано дозозависимое влияние MLi-2 приводит к увеличение уровня LC3-II к LC3-I, увеличению соотношения тетрамерной формы бека альфа-синуклеина к его мономерной форме на фоне снижения соотношения уровня фосфорилированного белка альфа-синуклеина к его мономерной форме. В настоящем исследовании мы расширили представления о функции LRRK2 в клетках и патогенезе БП за счет ингибирования активности киназы LRRK2 в различных клеточных линиях: в первичной культуре макрофагов пациентов с GBA1-БП и LRRK2-БП, а также в клеточной линии SH-SH5Y. Наши результаты подтверждают роль LRRK2 в регуляции функции GCase. Показано влияние MLi-2 на аутофагию в первичной культуре макрофагов пациентов с GBA1-БП. В тоже время, ингибирование киназной активности LRRK2 оказалось эффективным для фермента GALC активность которого снижена в первичной культуре макрофагов пациентов с LRRK2-БП. Полученные результаты расширяет представление о функциях LRRK2 и о возможной роли LRRK2 и в том числе и роли в патогенезе БП.