Аннотация результатов, полученных в 2022 году
I. Конструирование экспериментальной модели бактериофаговой трансдукции генетических маркеров, плазмидной локализации, в кишечнике двустворчатого моллюска, Unio pictorum. 1. Проведен анализ данных по бактериофагам, родственным T4, чья экологическая ниша свойственна двустворчатым моллюскам. Подобран фаг (Aeromonas phage L9-6), отвечающий следующим условиям: наличие в геноме гомологов генов, чьи продукты участвуют в синтезе 5-гидроксиметилцитозина (для увеличения успешности рекомбинации с T4), наличие белка Hoc, возможность инфицирования бактерий, родственных бактериям найденных в микрофлоре моллюсков. Проведен анализ доменов белка Hoc фага L9-6, выделены иммуноглобулин-подобные домены. Получена последовательность химерного гена hoc, состоящего из домена, участвующего в прикреплении белка Hoc к капсиду фага T4 и иммуноглобулин-подобных доменов белка Hoc фага L9-6. Проведено моделирование химерного белка Hoc, установлена его вероятная структура и схожесть данной структуры с известными структурами белков Hoc и иммуноглобулин-подобными белками. Проведена оптимизация использования кодонов в химерном гене hoc относительно средних и поздних генов фага T4. Синтезирован химерный ген hoc, проведена его вставка в плазмиду. Секвенированием проверена структура полученных рекомбинантных плазмид. Получен штамм E.coli, несущий данную плазмиду. 2. Проведена рекомбинация фага T4alc7 с искусственной конструкцией, несущей химерный ген hoc. Получены мутанты фага T4alc7, у которых исходный ген hoс заменен химерным (T4alc7hocL9). T4alc7hocL9 проверены на наличие химерного гена hoc и отсутствие исходного гена путем ПЦР со специфическими праймерами к данным генам. 3. Проверены трансдукционные свойства полученных фагов- рекомбинантов по гену hoc (T4alc7hocL9). Определена возможность осуществления трансдукции фагом T4alc7hocL9 in vitro. Также определено, что частота трансдукции Также определено, что частота трансдукции in vitro у T4alc7hocL9 (примерно 1,3×10^-4) выше, чем у T4alc7 (примерно 6×10^-6). Были получены данные, указывающие на возможность осуществления T4alc7hocL9 трансдукции в кишечнике моллюска. 4 Подобраны условия проведения эксперимента по трансдукции плазмид в кишечнике моллюска: 4.1. Подобрана плазмида pTurboB)для осуществления трансдукции в кишечнике, путем поиска необходимых маркеров (устойчивость к антибиотикам, флуоресценция) для детекции трансдуктантов. 4.2. Подобран штамм E.coli для более эффективного сохранения плазмид (RecBC+ - wt). 4.3. Подобраны питательные среды для уменьшения вероятности получения ложного результата (LB с антибиотиками, МакКонки с антибиотиками). 4.4. Исследована устойчивость микрофлоры кишечника двустворчатого моллюска к антибиотикам, подобран оптимальный набор антибиотиков для проведения трансдукции (ампициллин, хлорамфеникол) 4.5. Определена возможность заражения кишечника моллюска штаммом E.coli, используемым для трансдукции, а также сохранение его в кишечнике в течение не менее 3 суток. 4.6. Определена возможность инфицирования и сохранения в кишечнике бактериофагов T4alc7 и T4alc7hocL9. 5. В первые в мире проведены успешные эксперименты по трансдукции фагами T4alc7 и T4alc7hocL9 бактерий E. coli 5K в кишечнике lдвустворчатого моллюска, получены клоны бактерий штамма 5К, устойчивые к хлорамфениколу и ампициллину и растущие на селективной среде для энтеробактерий. Эксперименты проведены в том числе с использованием специально сконструированного методами геномной инженерии бактериофага T4alc7hocL9, в котором три Ig - подобных домена белка Нос бактериофага Т4 заменениы на один N-концевой Ig - подобный домен белка Нос бактериофага L9-6 аэромонад. То есть, не только сконструирована новая лабораторная модель для исследования горизонтального переноса генов в условиях моделирующих природные, но и методами молекулярной генетики создана база для исследования влияния конкретных, зависящих в своей структуре от экологической ниши, Ig - подобных доменов декорирующих белков капсида бактериофагов на генетические процессы у бактерий в пресноводной среде. II. Исследование новых возможностей и глубокая модификация, так называемой "мышиной" модели фаговой трансдукции плазмид псевдо-Т-четными бактериофагами в природных условиях. 1. Были приготовлены препараты трансдуцирующих псевдо-Т-четных бактериофагов RB43, RB49, RB42, содержащих плазмиды pUC19, pBR322, pTurboB. Была проведена трансдукция in vitro данными фагами в несколько разных штаммов E.coli (KLF-47, GM1737, 5K). Для RB43 частота трансдукции варьировала от 10-^3 до 10^-5 , для RB49 - она составила 10^-5 - 10^-7, для RB42 - 10^-4 до 10^-5 2. Была разработана новая модель трансдукции на основе псевдо-Т-четных бактериофагов, содержащих плазмиду pTurboB, экспрессирующую зеленый флуоресцирующий белок TurboGFP. Модель была протестирована in vivo в мышах и in vitro в нескольких штаммах E.coli (KLF-47, GM1737, 5K). Модель показала свою эффективность для отбора трансдуктантов in vivo, in vitro, но требует доработки. Фаговые препараты для осуществления трансдукции данной плазмиды можно применять в условиях трансдукции в животных с антибиотикорезистентной микрофлорой. Для RB42 и RB43 частота трансдукции pTurboGFP-B варьировала от 10^-4 до 10^-5 , для RB49 - она составила 10^-6 - 10^-7. 3. Было показано, что трансдуцирующие частицы RB43 и RB49 могут хорошо сохраняться в течение месяца при 37 °С и 7 °С. Было показано, что частота трансдукции pUC19 RB43 и RB49 может возрасти в 1000-8750 раз соответственно при хранении в течение месяца при 37 °С. Было показано, что частота трансдукции pBR322 RB49 и RB43 может возрасти в 10-77 раз соответственно при хранении в течение месяца при 37 °С. 4. Была проверена способность к трансдукции препаратов фагов, хранящихся при 7 °С в течение 22 лет. RB42, содержащий плазмиды pET3b и pLysS, сохранил трансдуцирующие свойства, более того, по всей видимости, число трансдуцирующих частиц преобладало над вирулентными, поскольку частота трансдукции была в пределах 1. Титр фагов был в пределах 3×10^2 БОЕ/мл. 5. Была успешно проведена in vivo трансдукция плазмиды pUC19 бактериофагом RB43 в бактерии толстого кишечника мыши. Было получено 5 трансдуктантов, устойчивых к канамицину, ампициллину и хлорамфениколу. Содержание транспортируемых плазмид в клонах-трансдуктантах полученных в ходе исследования трансдукции псевдо-Т-четными бактериофагами в кишечнике мыши было подтверждено наличием устойчивости к антибиотикам, а также выделением плазмид и специфическим ПЦР с праймерами к гену бета-лактамазы. 6. Была успешно проведена in vivo трансдукция плазмиды pTurboGFP-B бактериофагом RB49 в бактерии толстого кишечника мыши. Было получено 123 трансдуктанта, устойчивых к хлорамфениколу, тетрациклину и ампициллину. Содержание транспортируемых плазмид в клонах-трансдуктантах полученных в ходе исследования трансдукции псевдо-Т-четными бактериофагами в кишечнике мыши было подтверждено наличием устойчивости к антибиотикам, а также выделением плазмид и специфическим ПЦР с праймерами к гену бета-лактамазы.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Эксперимент с моллюсками 1. Проведено сравнение трансдукции бактериофагов T4alc7 и T4alc7hocL9 (изменен ген hoc, получен на первом году проекта) в кишечнике моллюска. В эксперименте использовался штамм E.coli 5K, в качестве целевой плазмиды была использована pTurboGFP-B, содержащая гены устойчивости к ампициллину, хлорамфениколу, а также ген синтеза TurboGFP. Для эксперимента использовалось 10 моллюсков вида Unio pictorum: моллюск 1 – контроль микрофлоры моллюсков, моллюск 2 – исследование трансдукции частицами T4alc7 без добавления E.coli 5K, моллюск 3 – исследование трансдукции частицами T4alc7hocL9 без добавления E.coli 5K, моллюск 4 – исследование микрофлоры моллюска после добавления E.coli 5K, моллюски 5-7 – опыты по трансдукции частицами T4alc7 при добавлении E.coli 5K, моллюски 8-10 – опыты по трансдукции частицами T4alc7hocL9 при добавлении E.coli 5K. Была показана трансдукция фагами T4alc7 и T4alc7hocL9 в кишечнике или мягких тканях двустворчатого моллюска. По полученным результатам можно отметить, что частота трансдукции в эксперименте с моллюсками оказалась выше частоты in vitro (2,4•10^(-5) и 3,3•10^(-5) для T4alc7 и T4alc7hocL9 соответственно), что вероятно связано с возможностью концентрирования фаговых частиц на поверхности слизи моллюсков за счет белка Hoc. Различия в результатах по трансдукции T4alc7 и T4alc7hocL9 связаны с наличием разного количества Ig-подобных доменов (T4alc7 имеет 3 домена, T4alc7hocL9 – 1). 2. Проведены исследования возможного влияния коинфекции фагов при трансдукции. При коинфекции вирусов, принадлежащих к одному штамму, не наблюдается заметных изменений в частоте трансдукции, что было показано при коинфекции фагов T4alc7 и T4alc7hocL9 методом агаровых слоев и сравнении частоты трансдукции). При коинфекции вирусов разных родов у фагов T4-родственных в случае фагов T4 и RB69-подобного фага PuMWB13 наблюдается исключение фага T4 из инфекции, кроме того, как нами было показано методом электрофореза фаговых частиц также наблюдается снижение концентрации PuMWB13. Полученные данные могут указывать на возможные проблемы при эксперименте по трансдукции при коинфекции фагов близких родов, а метод электрофореза фаговых частиц может быть использован для оценки возможности исключения родственных фагов с отличными белками hoc из инфекции. При коинфекции фагов более удаленных родственных групп, как показано нами при анализе геномов фагов актинобактерий, на примере фага Saccharomonospora phage PIS 136, который вероятно является фагом плазмидой и может существовать в клетке в виде профага, за счет гомологичных участков геномов, возможны рекомбинационные процессы, которые также будут влиять на частоту трансдукции. 3. Проведена оптимизация отбора и детализирован анализ трансдуктантов из моллюсков. Для этого нами были использован метод агаровых слоев с добавлением необходимых антибиотиков для селекции. В результате было найдено, что возможно получение более высокой частоты трансдукции на чашках с двумя агаровыми слоями, более того, такой метод позволяет анализировать большие объемы пробы с трансдуктантами (до 1 мл). Был проведен анализ трансдуктантов из моллюсков методом фаготипирования, ПЦР и высева на Макконки с антибиотиками. Учитывая отсутствие в контрольных моллюсках 1 и 2 устойчивых к ампициллину и левомицетину бактерий, чувствительность трансдуктантов к целевым фагам, наличия специфических ампликонов в клетках, свойственного плазмиде pTurboGFP-B (но размера отличного от целевого ампликона), рост на Макконки с Str50, Amp50, Lm50 (или Amp50, Lm50) можно судить, что на чашках с антибиотиками с высевами из тканей моллюсков образовывались трансдуктанты, внутри которых происходили особые рекомбинационные события. 4. Проведено секвенирование тотальной ДНК бактериофагов после трансдукции in vitro и после трансдукции в моллюске. II Эксперименты с мышами 1. Было показано, что бактериофаги RB43, RB49 способны осуществлять высокочастотную трансдукцию плазмид и фрагментов плазмид находящиеся в ЖКТ мышей штаммы E.coli. Было в одном из опытов показано, что трансдукция может проходит не только в искусственно вносимый нами лабораторный штамм-реципиент, но и в собственные штаммы кишечника мыши. В толстом кишечнике мыши трансдукция генов резистентности проходит с частотой даже выше, чем в условиях in vitro. Вклад общей трансдукции в эволюции популяции бактерий и приобретению ими генов антибиотикорезистентности может быть гораздо выше, чем оценивается сейчас. Мы рекомендуем, воздержаться от использования диких фагов RB43, RB49 и им родственных в качестве агентов фаговой терапии. 2. В результате наших опытов, мы открыли ранее неизвестный механизм протекания трансдукции плазмидной ДНК для бактериофагов RB43 и RB49, а также для трансдуцирующих мутантов Т4 – T4alc7 и T4alc7hocL9 Мы предполагаем, что в результате взаимодействия трансдуцирующих частиц фага RB43, содержащих pUC19, и клеток E.coli в условиях ЖКТ мыши могла произойти рекомбинация между вводимым фагом конкатемером из плазмидной ДНК pUC19 и ДНК E.coli. Поскольку мы наблюдали в процессе работы с трансдуктантами изменения в метаболизме лактозы, мы предполагаем, что вставка части ДНК pUC19 могла произойти именно в районе лактозного оперона E.coli. В зависимости от места вставки гена бета-лактамазы наблюдаются нарушения, либо отсутствия нарушений в способности клеток сбраживать лактозу. Плазмида pTurboGFP-B несет в себе область терминатора фага лямбда длиной около 95 пн. Вводимый нами штамм-реципиент предположительно мог нести в себе гомологичный участок в составе хромосомы, поскольку штамм 5K был получен от штамма К-12, излеченного от лямбды, область терминатора могла сохраниться, поскольку нет полного генома этого штамма в базах данных мы не можем это утверждать наверняка. Косвенно это подтверждается результатами ПЦР-теста на хромосоме 5К. По данным нашего ПЦР-анализа, мы можем предположить, что и ген turboGFP также вставился в хромосому реципиента, однако, произошли изменения, повлекшие за собой отсутствие возможности нормальной его экспрессии, что выражается в отсутствии флуоресценции клонов-трансдуктантов. Вероятно происходила индукция SOS-ответа в клетках чаще, чем в условиях, создаваемых нами in vitro, вследствие чего мы получили большое число рекомбинантных клеток E.coli c фрагментами вносимых нами плазмид именно в опытах in vivo. Точно подтвердить наши предположения о рекомбинации можно будет подтвердить только по результатам секвенирования тотальной ДНК клонов-трансдуктантов, которое мы проводим в данное время. 3. Выдвинуто предположение, что на механизм протекания трансдукции в условиях ЖКТ оказывает сильное влияние и штамм-реципиент, где проходит трансдукция. Так, в одном из опытом нами был использован штамм KLF-47, имеющий F-фактор, интегрированный в хромосому и нами удалось успешно получить трансдуктанты на его основе, из которых удалось выделить плазмидную ДНК, введенную за счет фага. 4. Было проведено исследования влияние температуры, рН и УФ (366 нм) на частоту трансдукции плазмиды pTurboGFP-B фагом RB49. Показано, что трансдуцирующие частицы хуже сохраняются при температурах от 60°C. В результате воздействия 0, 5 % HCl на препарат фага в течение 40 минут произошла полная инактивация фаговых частиц, воздействие 0,2 н NaOH практически инактивировала действие фаговы. Частота трансдукции препарата снизилась до очень низких. В результате воздействия УФ (366 нм) на препарат фага в течение 180 минут титр фага упал примерно в 1.5 раза, частота трансдукции выросла примерно в два раза по сравнению с частотой препарата фага, который находился в темноте при комнатной температуре. На основе полученных экспериментальных данных можно сделать предположение о том, что трансдуцирующие частицы могут быть более устойчивы к действию длинноволнового УФ-излучения.