Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Наиболее распространенным фактором повышенного риска развития болезни Паркинсона (БП) являются мутации в гене глюкоцереброзидазы (GBA). В гомозиготном, а также в компаундном гетерозиготном состоянии, мутации в данном гене приводят к снижению ферментативной активности глюкоцереброзидазы (GCase), повышению уровня её субстрата гексозилсфингозина (HexSph) как в клетках мозга, так и периферической крови, и развитию наследственного заболевания, относящегося к классу лизосомных болезней накопления болезни Гоше (БГ). Следует отметить, что в настоящее время вся терапия БП носит симптоматический характер, а препараты для лечения БГ не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В связи с этим всё больше обсуждается использование фармакологических шаперонов (ФШ) GCase для терапии как GBA-ассоциированной БП (GBA-БП), так и нейропатических форм БГ. Эта стратегия предполагает применение химических соединений, которые способны проникать через ГЭБ, избирательно связывать и стабилизировать мутантную форму GCase, приводя к повышению активности фермента в месте действия — лизосомах — и снижению концентрации его субстрата в клетках. Данный подход имеет большие перспективы и актуальность, позволяя использовать ФШ в качестве персонализированной терапии носителей мутаций в гене GBA, позволяя модифицировать клиническое течение нейропатических форм БГ, а также GBA-БП. На сегодняшний день описано всего три потенциальных ФШ (NCGC00188758, NCGC00241607 и LTI291), способных связываться с ферментом вне активного центра (то есть не являющихся конкурентными ингибиторами), и обладающих как подтвержденной эффективностью на различных биологических объектах, включая пациент-специфические клетки, так и низкой токсичностью. Наряду с указанными выше химическими соединениями, наиболее близким для внедрения в клиническую практику (вторая стадия клинических исследований) является известный препарат от кашля амброксол, чья активность в качестве ФШ была обнаружена путём проверки влияния 1040 одобренных к применению лекарственных препаратов на восстановление активности рекомбинантной формы GCase при термической денатурации с последующим подтверждением эффективности в восстановлении активности GCase на различных пациент-специфичных клетках пациентов с GBA-БП и БГ. Данный подход является распространённым и позволяет производить быстрый поиск препаратов для лечения различных патологий, однако обладает трудоёмкостью, большими материальными затратами на проводимые исследования, а также трудности, сопряжённые с исследованиями различных мутантных форм белка. Альтернативой экспериментальным методам репозиционирования и поиска новых лекарственных средств являются методы молекулярного моделирования, обладающие предсказательной силой и позволяющие быстро модифицировать модель белка с известной пространственной структурой (гликозилирование, аминокислотные замены), учитывать физико-химические условия окружающей среды, приближенные к нативному состоянию в клетке, и в относительно короткие сроки проводить скрининг обширных баз данных химических соединений. В настоящем исследовании мы провели виртуальный скрининг широкого круга известных лекарственных препаратов потенциальных ФШ наиболее распространенной мутантной формы N370S GCase, не являющихся конкурентными ингибиторами фермента и проверка их активности на пациент-специфичных клетках, полученных от пациентов с БГ и GBA-ассоциированной формой БП. В рамках реализации задач исследования проводили методами молекулярного моделирования в два этапа, используя сконструированную нами ранее атомарную модель мутантной формы GCase N370S. Сначала был проведен виртуальный скрининг 4178 соединений, входящих в состав базы данных ZINC Drug Database (ZDD) и являющиеся лекарственными препаратами и биологически активными добавками, одобренными к применению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) и свободно доступными в продаже в виде чистых соединений. В результате были отобраны 52 соединения, обладающих наименьшей величиной расчётной оценочной функции, характеризующей сродство к белку. Данные препараты принадлежали различным фармакологическим группам, из которых для дальнейшего исследования выбрали 12, приём которых в клинической практике возможен длительное время. Стабильность комплексов GCase с отобранными химическими соединениями проверяли методом молекулярной динамики с явным учётом водного окружения. Из всех анализируемых комплексов свободной энергией связывания ниже −35,0 ккал/моль, обладало восемь химических соединений. Для сравнения минимальная свободная энергия связывания амброксола составляет -51.0+3.0 ккаль/моль. Из выбранных соединений сопоставимой энергией связывания обладало 4 соединения ребамипид, бенфотиамин, ново-фолацид (витамин B9) и флавин-мононуклеотид. Также было обнаружено, что из всех исследованных методом молекулярной диннамики соединений альмитрин связывается с GCase с наименьшей свободной энергией (-90.4 ± 14.0 ккаль/моль). Также в данном исследовании нами впервые было оценено влияние известного ФШ NCGC00241607 (далее N07) на активность и количество фермента GCase, уровень его субстрата HexSph на первичной культуре макрофагов пациентов с БГ, GBA-БП и индивидуумов контрольной группы, а также дофаминергических нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента с GBA-БП и индивидуумов контрольной группы. Было показано, что соединение N07 способствует повышению активности GCase и уровня фермента, а также снижению концентрации субстрата HexSph в первичной культуре макрофагов пациентов с БГ по сравнению с необработанными клетками (p<0.05). Также была обнаружено, что добавление к макрофагам пациентов с БГ соединения N07 способствовало более выраженному снижению концентрации HexSph у носителей «легких мутаций» (N370S, R120W, W184R, V375L) по сравнению с «тяжелыми» (L444P, c84dupG). Кроме того, было показано, что ФШ N07 способствовал увеличению ферментативной активности GCase в первичной культуре макрофагов пациентов с GBA-БП, носителей «легкой» мутации GBA (N370S), в то время как не оказывал влияния на данный показатель у пациентов с «тяжелой» мутацией GBA (L444P). В рамках первого года реализации проекта нам удалось получить ИПСК-индуцированные дофаминергические (ДА) нейроны пациента с GBA-БП и двух индивидуумов контрольной группы, охарактеризовать и проверить на них активность амброксола и известного аллостерического активатора ФШ N07. В результате было показано, что как амброксол, так и соединение N07 повышают активность и уровень GCase в ДА нейронах, дифференцированных из ИПСК, пациента с GBA-БП (p<0.05). Однако влияния исследуемых соединений на концентрацию субстрата фермента в ДА-нейронах обнаружено не было. Также на ДА-нейронах исследуемых индивидуумов нами было выявлено, что эффективность амброксола в повышении активности и относительного уровня GCase была более выражена по сравнению с соединением N07 (p<0.05). Таким образом, в результате проведённого исследования из расширенной базы одобренных к применению лекарственных препаратов были выбраны потенциальные фармакологические шапероны GCase, способность которых повышать её ферментативную активность, а также снижать уровень субстрата гексозилсфингозина HexSph требует дальнейшего изучения. Кроме того, впервые была показана эффективность известного ФШ NCGC00241607 в восстановлении активности и уровня GCase в ДА-нейронах пациента с GBA-БП, а также в экспериментах на первичной культуре макрофагов обнаружена более выраженная эффективность данного соединения у пациентов с БГ по сравнению с пациентами с GBA-БП.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Наиболее распространенным фактором повышенного риска развития болезни Паркинсона (БП) являются мутации в гене глюкоцереброзидазы (GBA). В гомозиготном, а также в компаундном гетерозиготном состоянии, мутации в данном гене приводят к снижению ферментативной активности глюкоцереброзидазы (GCase), повышению уровня её субстрата гексозилсфингозина (HexSph) как в клетках мозга, так и периферической крови, и развитию наследственного заболевания, относящегося к классу лизосомных болезней накопления болезни Гоше (БГ). Следует отметить, что в настоящее время вся терапия БП носит симптоматический характер, а препараты для лечения БГ не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В связи с этим всё больше обсуждается использование фармакологических шаперонов (ФШ) GCase для терапии как GBA-ассоциированной БП (GBA-БП), так и нейропатических форм БГ. Эта стратегия предполагает применение химических соединений, которые способны проникать через ГЭБ, избирательно связывать и стабилизировать мутантную форму GCase, приводя к повышению активности фермента в месте действия, лизосомах, и снижению концентрации его субстрата в клетках. Данный подход имеет большие перспективы и актуальность, позволяя использовать ФШ в качестве персонализированной терапии носителей мутаций в гене GBA, позволяя модифицировать клиническое течение нейропатических форм БГ, а также GBA-БП. В связи с этим поиск новых ФШ на сегодняшний день является актуальной задачей. Одним из подходов для выявления ФШ является репозиционирование известных и одобренных к применению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) соединений с использованием методов молекулярного моделирования, позволяющим в относительно короткие сроки проводить скрининг обширных баз данных химических соединений с целью поиска потенциальных соединений, способных связываться с GCase и повышать ее активность, одновременно снижая концентрацию субстрата фермента HexSph. В рамках реализации настоящего проекта в этом году был продолжен поиск потенциальных ФШ методом молекулярного моделирования, а именно, из найденных на первом этапе работы (2022 год) 12-и соединений отобрали 8 (олопатадин, бенфотиамин, 4-гидроксидулоксетин b-D-глюкуронид, глютатион, флавинмононуклеотид, альмитрин, новофолацид, ребамипид), для которых рассчитанная методом MMGBSA свободная энергия связывания была наименьшей. Для выявления механизма работы исследуемых молекулярных шаперонов необходимо обладать информацией о структурных особенностях тройного комплекса GCase N370S – субстрат фермента, глюкоцереброзид, в активном центре - химическое соединение. Такие тройные комплексы построили методами молекулярного моделирования. Все восемь соединений в ходе МД продемонстрировали стабильное связывание в аллостерическом сайте фермента хотя бы в одной из поз, отобранных по результатам докинга. Показали, что присутствие глюкоцереброзида в активном центре фермента приводит как к увеличению (олопатадин, глютатион, флавин мононуклеотид, альмитрин), так и уменьшению (бенфотиамин, 4-Гидроксидулокситин b-D-глюкуронид, новофолацид, ребамипид) свободной энергии связывания исследуемых соединений, рассчитанной методом MMGBSA. Семь из восьми соединений связываются с комплексом GCase N370S – глюкоцереброзид с энергией менее 35 ккаль/моль. Из всех исследованных методом молекулярной динамики соединений альмитрин связывается с комплексом GCase N370S - глюкоцереброзид с наименьшей свободной энергией (-100.01±6.63 ккаль/моль). Связывание соединений в аллостерическом сайте способно приводить к изменению подвижности аминокислотных остатков, формирующих петли L4 и L7, находящиеся на входе в активный центр. Некоторые из соединений способны изменять подвижность аминокислотных остатков, находящихся на удалении от сайта связывания. Кроме того, в рамках реализации настоящего проекта нами были выбраны пять соединений ((мононатриевая соль бенфотиамина (аналог витамина B1), альмитрина мезилат (препарат для лечения дыхательной недостаточности), глютатион (препарат, относящийся к классу антигипоксантов и антиоксидантов), ребамипид (гастропротектор), олопатадин (антигистаминовое средство))), обладающие наименьшей расчетной энергией связывания с GCase, а также коммерчески доступные. Произведена очистка действующего вещества (гидрохлорида олопатадина) из антигистаминового препарата Олопасана, а также путем химической модификации получена водорастворимая форма другого соединения бенфотиамина. Для всех соединений произведена виртуальная количественная оценка проницаемости через гематоэнцефалический барьер и показано, что для трех (олопатадин, бенфотиамин, альмитрин) из пяти расчетная величина проницаемости была сопоставима с известными ФШ амброксолом, NCGC00241607 и NCGC00188758. Однако, значения проницаемости через ГЭБ находятся на низком уровне, что обуславливает в случае применения в клинической практике с целью повышения активности GCase исследуемых нами препаратов использования повышенных доз или введение химических модификаций, повышающих их способность проникать через ГЭБ. В рамках настоящего исследования нами также была проведена оценка влияния выбранных пяти соединений (мононатриевая соль бенфотиамина, альмитрина мезилат, глютатион, ребамипид, олопатадин) в подобранной нетоксичной для клеток концентрации на активность GCase и количество субстрата HexSph при добавлении их к клеткам первичной культуры макрофагов пациентов с GBA-ассоциированной формой БП (N=1) и пациентов с болезнью Гоше (БГ) (N=2), а также индивидуумов контрольной группы (N=5). Следует отметить, что оценка влияния пяти оцениваемых соединений на активность GCase и концентрацию HexSph в клетках первичной культуры макрофагов проводилась у каждого представителя исследуемых групп отдельно. При этом обращает на себя внимание, что в отношении активности GCase, а также концентрации HexSph в клетках первичной культуры макрофагов индивидуумов исследуемых групп положительный эффект оказывали глютатион, бенфотиамин и ребамипид (р<0,05). При этом у отдельных индивидуумов эффект демонстрировало разное количество соединений в различных концентрациях. При объединении представителей группы контроля, пациентов c БГ в отдельные группы и сравнении внутри них влияния соединений на исследуемые параметры было показано, что из всех оцениваемых соединений свою эффективность показали только бенфотиамин и глютатион в отношении активности GCase (р<0,05), а также бенфотиамин (р<0,05) в отношении концентрации HexSph при добавлении соединений к клеткам индивидуумов контрольной группы. Несмотря на полученные положительные результаты, по оцениваемым соединениям для уточнения и верификации наблюдаемых эффектов необходимо продолжение исследования на более расширенных выборках с увеличением количества технических повторов для каждого образца клеток. Кроме того, необходимо расширение линейки концентраций выбранных соединений, что может быть реализовано, тк многие из них не приводят к значительной гибели клеток в широком диапазоне значений. Таким образом, проведенное исследование позволило обнаружить потенциальную способность соединений глютатион, бенфотиамин и ребамипид при добавлении к клеткам первичной культуры макрофагов представителей исследуемых групп повышать активность GCase и снижать концентрацию HexSph. При этом у отдельных индивидуумов эффект демонстрировало разное количество соединений в различных концентрациях. Также было показано, что тройные комплексы GCase с субстратом в активном центре и оцениваемым соединением стабильны, а наибольшая энергия связывания среди всех соединений наблюдается для альметрина. Связывание соединений с ферментом в такой форме может влиять на подвижность петель L4 и L7.