Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Мы подтвердили гипотезу о том, что существует связь между высоко инвазивным и эффективно эндоцитирующим фенотипами раковых клеток. Было подтверждено наличие корреляции в эффективности интернализации и инвазивности одних и тех же клеток, а именно: мы обнаружили прямую связь между метастатическим потенциалом клеток рака молочной железы (РМЖ) и их способностью инкапсулировать (а так-же адгезировать) частицы размерами 100 и 200 нм. Эффективность инкапсуляции и адгезии в доброкачественных клеток была того же порядка, что и зарегистрированный контрольный фон. Это означает, что нормальные (доброкачественные) клетки не усваивают и не адгезируют частицы размером 100 и 200 нм в течение измеренного периода времени в 1 час. 2. С другой стороны, способность интернализировать и адгезировать более крупные частицы (480 и 1000 нм) не различалась между клетками РМЖ с высоким и низким метастатическим потенциалом (МП). Данным образом, была проведена характеризация эндоцитарных путей субпопуляций раковых клеток. Мы определили, что рецепторно-опосредованный эндоцитоз раковых клеток существенно различается для клеток с различным МП, тогда как эндоцитоз крупных частиц (фагоцитоз и пиноцитоз) не связан с их высоко-инвазивным фенотипом. 3. Мы провели изоляцию высоко-инвазивных клеточных субпопуляции из различных клеточных линий, и изучили их интернализующие способности. Мы доказали нашу рабочую гипотезу о прямой связи между способностью раковых клеток к миграции и склонностью к эндоцитозу нано-частиц. Из нашего эксперимента по эндоцитозу наночастиц, мы показали, что мигрирующая (особо инвазивная) субпопуляция клеток с высоким МП демонстрирует значительное увеличение скорости и эффективности адгезирования и интернализации наночастиц (200 нм) по сравнению с гетерогенными и не мигрирующими. С другой стороны, интернализация наночастиц клетками не способными к миграции была одинакова для обеих клеточных линий и не зависела от изначального МП клеток, что подтверждает гипотезу что именно высоко-инвазивные и мигрирующие клетки проявляют повышенную способность к эндоцитозу. В результате экспериментов, мы установили, что именно высоко мигрирующая субпопуляция (каждой из проанализированных клеточных линий) имеет повышенную эффективность эндоцитоза. 4. Кроме механобиологических признаков, была проведена полная морфологическая характеристика выделенных субпопуляций, а также гетерогенных клеточных линий. Полученные цифровые изображения были проанализированы и следующие параметры были определены/рассчитаны для каждой клетки на изображении: площадь клетки, периметр, округлость, соотношение сторон, закругленность, компактность, эксцентричность. Такая характеристика проявила морфологические различия между выделенными субпопуляциями (высоко – и низко- инвазивными; высоко- и низко- эндоцитирующими) раковых клеток. Для обоих клеточных линий, площадь и периметр особо инвазивных субпопуляций (прошедших через камеры Бойдена) был существенно выше (p<0.01) чем площадь и периметр не мигрировавших субпопуляций. 5. Выявленные морфологические признаки различных субпопуляций только подтверждают их различные механобиологические признаки и различные уровни способности к эндоцитозу – это позволило нам сделать выводы о наличии общих маркеров для всех отличных (от нормальных клеток) характеристик для особо метастатичных клеток. Интенсивный био-инфоматический анализ выявил потенциальные био-маркеры, которые могут являться общими показателями для исследованных процессов. В процессе анализа были выявлены внутриклеточные процессы общие для процессов инвазии и эндоцитоза, за этим последовал отбор общих для процессов инвазии, миграции и эндоцитоза белковых биомаркеров. Из из 1245, упомянутых в литературе биомаркеров инвазивности рака, нами были отобраны 10 потенциальных кандидатов, которые непосредственно связаны с ремоделированием актинового цитоскелета. Актуальность нашего теоретического литературного отбора мы проверили с помощью анализа базы данных Cancer Dependency Map, и смогли показать прямую корреляцию между находящимися в клетках РМЖ маркерами типично относящихся к эндоцитозу и маркерами, определенными для характеристики миграции и инвазии клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Характеристика связи между способностью клеток к миграции и эффективностью эндоцитоза. Миграция раковых клеток является первичным этапом в формировании метастаз. При этом большинство видов опухолей распространяются с помощью коллективной миграции, когда группа клеток движется вместе, направляемая и ведомая несколькими «клеточными лидерами». Процессы, происходящие с цитоскелетом во время клеточной миграции, схожи ц процессами при эндоцитозе. В результате экспериментов было рассчитано время наиболее интенсивного закрытия раны для клеток с различным метастатическим потенциалом (МП). Этот временной промежуток использовался для последующих экспериментов с инкапсуляцией наночастиц. В соответствии с предыдущими результатами мы получили существенную разницу в интенсивности инкапсуляции между клетками с высоким и низким МП, однако статистически значимая разница между коэффициентами инкапсуляции на краю и в отдалении от раны не была получена ни для одной клеточной линии в заданный временной промежуток. 2. Выделение и сортировка субпопуляции клеток с различной способностью к интернализации частиц выла проведена с помощью проточной цитометрии. Традиционная поточная цитометрия измеряет и анализирует частицы диаметром от 1 до 15 микрон, в то время как для обнаружения наночастиц размером 0,1–0,2 микрона требуются специализированные системы. Нам удалось успешно разделить клетки с различным МП, инкубированные с частицами диаметром 200 нм используя традиционную технику поточной цитометрии. В отличие от микроскопии, с помощью цитометрии не было получено достаточного различия между клетками только с интернализированными частицами и клетками с интернализированными и адгезированными частицами. Более того, чтобы получить существенное количество экспериментальных данных с использованием традиционной поточной цитометрии, количество клеток для каждого эксперимента должно быть увеличено на три порядка величины. Такое количество обычно сложно собрать из образцов биопсий из тканей молочной железы. Кроме того, увеличение количества клеток обязательно приводит к увеличению числа наночастиц, что делает этот метод более дорогостоящим. 3. Нами была произведена оценка клеточного цикла, пролиферативных способностей и маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в изолированных субпопуляциях клеточных линий. При инвазии клетки изменяют свою форму и воздействуют на окружающую их среду, происходит эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и при этом меняется экспрессия таких маркеров как E кадгерин и N кадгерин (показатели эпителиального и мезенхимального фенотипа соответственно). Для всех субпопуляций клеток РМЖ с высоким МП были наблюдали максимальную интенсивность эндоцитоза и экспрессию Vimentin. Анализ маркеров Snail 1/2 не показал статистически значимых различий между клеток с высоким и низким МП. Клетки с высоким МП характеризуются подвижным цитоскелетом и мягкой внутриклеточной средой, имеют мезенхимальный фенотип. Мы установили что высоко инвазивные клетки больше и круглее в сравнении с низко инвазивными; экспрессия N кадгерина возрастает, Е кадгерина падает. Это коррелирует с теорией мягкого цитоскелета для клеток с высоким МП и подтверждает, что высоко инвазивные клетки совершают ЭМП. Анализ степени пролиферации выделенных клеточных субпопуляций показал что процент пролиферирующих клеток с низким МП статистически не различается у инвазивной и не инвазивной субпопуляции, и существенно ниже чем у изначальной гетерогенной клеточной популяции. В это же время, процент пролиферирующих клеток с высоким МП гораздо выше у выделенных субпопуляций по сравнению с изначальной гетерогенной клеточной популяцией. Интенсивность пролиферации также была существенно выше для всех субпопуляций в клетках с высоким МП. 4. Временно-зависимая характеризация эндоцитарных путей субпопуляций раковых клеток была характеризована с помощью времени инкапсуляции наночастиц. Прежде всего был произведен литературный анализ зависимости клеточного эндоцитоза от времени инкапсуляции. Были выявлены следующие параметры влияющие на скорость инкапсуляции: радиус наночастиц, диффузионная способность рецепторов, степень взаимно-однозначного связывания лиганд-рецепторов, плотность лигандов. Проведенные эксперименты показали, что интенсивность интернализации наночастиц размером 200 нм клетками с высоким МП не изменяется в течении 15-60 минут. В то же время интенсивность интернализации клетками с низким МП изменяется в течении заданного временного промежутка. Можно сказать, что ранние эндосомы могут существовать в течение десятков минут, созревая в поздние эндосомы за это время. Поздние эндосомы могут существовать примерно столько же времени, прежде чем созревают в лизосомы, где происходит деградация. Весь процесс может занять несколько часов. 5. Исследования элементов цитоскелета различных выделенных клеточных субпопуляций влияющие на путь интернализации, проводились с помощью компартмент-специфических антител и флуоресцентных красителей. Анализ интенсивности внутриклеточного актина показал, что в клеточных линиях с высоким МП имеется гораздо больше актина чем в клетках с низким МП. Дополнительным проведенным анализом являлся анализ степени поляризации актина, с помощью специально разработанного программного модуля. Анализ степени поляризации актина показал, что во всех выделенных суб-популяциях актин более поляризован в клетках с низким МП. 6. Список определенных на первом году проекта био-маркеров был проверен с учетом экстенсивных характеристик 72 клеточных линий РМЖ. В результате био- инфоматического исследования, наиболее значимым параметром, позволяющим со статистической достоверностью различить как можно больше отдельных клеточных подгрупп РМЖ оказался уровень экспрессии выделенных генов (Expression). Параметр RNAi оказался наименее значимым для дифференцирования био-маркеров, т.к. из-за достаточно высокой дисперсии внутри одной и той-же клеточной подгруппы, не удалось выявить статистически значимую разницу между подгруппами, иными словами - провести кластеризацию. Среди 10 изученных маркеров, были выделены 3, для которых более 3-х изученных параметров отличались для двух и более подгрупп: TAGLN, FSCN1, ECM1; и два дополнительных маркера, для которых 2 параметра различались для двух и более клеточных подгрупп: PFN1, ANXA6. 7. Отобранные в результате исследования вышеперечисленных маркеры были изучены как цели для таргетной терапии с помощью анализа базы данных PRISM Repurencing, которая содержит наборы данных о жизнеспособности малых молекул, созданные с использованием библиотеки Broad Repurencing Library и мультиплексного анализа жизнеспособности клеточных линий. В результате био-информатического исследования, из более чем 4500 различных терапевтических агентов, от 130 до 266 химических соединений с существенным эффектом было определено для каждого маркера по пяти изученным параметрам (Gene Effect, Expression, Copy Number, RNAi, Proteomics). Наиболее часто встречающимися по совокупности влияемых генов и зависимых параметров являлись: DEHYDROEPIANDROSTERONE, RESIQUIMOD, LEVOMEPROMAZINE, BMS-806, MERBROMIN. Наиболее влияемыми генами оказались TAGLN, FSCN1, ECM1 (предсказательный успех терапии как минимум двумя препаратами из определенных пяти). Полученные результаты целей для таргетной терапии полностью совпадают с отобранными наиболее перспективными маркерами, подтверждая позитивную вероятность использования данных маркеров для определения метастатического потенциала опухолей РМЖ. 8. Экспрессия отобранных в пп. 6 маркеров была изучена в 11657 клинических образцах РМЖ из общедоступных баз данных. Био-информатические исследования показали что отобранные нами гены были изменены в 75,2% образцов инвазивного рака молочной железы, влияли на возрастание метастатического присутствия в среднем с 47,2% до 61,5%, и существенно ухудшали долгосрочный прогноз выживаемости.