КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-25-20167

НазваниеПрименение тканеинженерных конструкций для аугментационной цистопластики в эксперименте

РуководительМуравьев Александр Николаевич, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2023 г.

Конкурс№65 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые словатканеинженерная конструкция, аугментационная цистопластика, малый мочевой пузырь, биодеградируемые полимеры, поли-L,L-лактид, мезенхимные стволовые клетки

Код ГРНТИ76.29.46

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Актуальность темы исследования. Наиболее тяжелый контингент среди больных, страдающих заболеваниями мочеполовой системы, в том числе и туберкулезом, составляют пациенты с так называемым «малым мочевым пузырем» (Муравьев А.Н., Зубань О.Н., 2012). Практически всем этим больным требуется реконструктивно-восстановительная хирургическая помощь. В то же время, на сегодняшний день множество проблем, связанных с реконструктивной хирургией мочевого пузыря (МП), остаются нерешенными (Муравьев А.Н. и соавт., 2015). Во всём мире золотым стандартом в реконструкции мочевых путей при неэффективности консервативных методов лечения является замещение нефункционирующего МП участками желудочно-кишечного тракта, что нередко приводит к осложнениям (Семенов С.А., Муравьев А.Н., 2014; Gupta N.P. et al., 2008). Очевидно, что найти подходящий аналог ткани МП с ее уникальными свойствами совсем не легко. Тканевая инженерия является одной из ведущих тенденций в современной науке и подразумевает разработку методов восстановления или замещения поврежденных структур с применением скаффолдов и клеток. Однако, несмотря на огромный объем публикаций, реконструкция урологических структур освещена довольно скудно. В настоящее время для лечения поврежденных тканей и органов человека все более широкое применение находят биорезорбируемые синтетические полимерные материалы, которые используют в качестве основы для культивирования клеток (Ho M.H. et al., 2006; Shao J. et al., 2012). Зарубежные ученые давно предпринимают успешные попытки создания тканевых аналогов стенки МП (Pariente J.L. et al., 2002), применение «биоинженерных тканей» для трансплантации опробовано в экспериментальных условиях. В опыте in vivo МП у 14 собак успешно замещён резервуаром, выращенным in vitro (Oberpenning F. et al., 1999). После удачного эксперимента на лабораторных животных сгенерированный in vitro резервуар успешно трансплантирован человеку (Yoo J.J. et al., 2011). В своих работах исследователи использовали в качестве источника клеток аутологичные ткани МП, что исключено при отсутствия здорового уротелия и мышечной стенки, когда все ткани мочевого пузыря замещены рубцовыми. Наши исследования направлены на поиск возможности применения клеточных технологий для помощи именно пациентам, имеющим малый мочевой пузырь, в том числе и туберкулезной этиологии. Известно, что некоторые клетки организма не обладают выраженной иммуногенностью и подходят для аллогенной трансплантации. Аллогенные тканеинженерные кожные лоскуты применяются в клинической практике (Fabre J.W., 1991); для создания эпидермальных пластов успешно используются аллогенные кератиноциты и фибробласты (Мельцова А.Ж. и соавт., 2007; Швед Ю.А. и соавт., 2010; Thepot А. et al., 2011). Из всего многообразия клеточных источников выделяется группа мезенхимных стволовых клеток (МСК), которые обладают способностью воздействовать на иммунный ответ, снижая выраженность реакции на имплантат (Yan S. et al., 2013). In vitro доказана возможность дифференцировки МСК в клетки, обладающие свойствами гладкомышечных клеток, эндотелиальных и уротелиальных клеток. Поэтому они являются весьма заманчивым кандидатом для создания тканеинженерных аналогов стенки мочевого пузыря (DaSilva M.L. et al., 2006). Однако, полного понимания механизмов, отвечающих за защитные и регенеративные эффекты, пока не достигнуто. Результаты проведенных на сегодняшний день, безусловно, обнадеживают, однако они требуют более пристального изучения (Martínez-Montiel Mdel P. et al., 2014). В последние годы опубликованы результаты системной терапии МСК при различных заболеваниях (Onken J. et al., 2006; Liang J. et al., 2012; Du T., Zhu Y.J., 2014) и экспериментальные работы по реконструкции различных урологических структур, в том числе и МП (Coutu D.L. et al., 2014). Мировой опыт применения аллогенных МСК для реконструкции МП на сегодняшний день представлен единичными экспериментальными исследованиями (Yuan H. et al., 2013; Snow-Lisy D.C. et al., 2015; Yudintceva N.M. et al., 2016). В недавно проведенном экспериментальном исследовании на базе ФГБУ СПбНИИФ впервые в мировой практике на экспериментальной модели парциальной резекции мочевого пузыря выполнена имплантация тканеинженерного лоскута мочевого пузыря, содержащего МСК кролика, и изучена жизнеспособность in situ введенных в область дефекта мочевого пузыря клеток. (Orlova N.V. et al. 2019). Применение тканеинженерной конструкции, состоящей из композитной матрицы и МСК кролика, оказалось эффективным для реконструкции небольших дефектов мочевого пузыря. Восстановление морфологической структуры стенки МП подтверждено гистологически. Полученные результаты диктуют необходимость дальнейших исследований в области реконструкции стенки МП.

Ожидаемые результаты
В настоящее время для реконструкции мочевого пузыря при формировании применяют различные участки желудочно-кишечного тракта, однако данные методики имеют ряд осложнений: возникновение расстройств мочеиспускания, инфекционные и метаболические нарушения, повышенная выработка слизи и камнеобразование. Поэтому актуальным является поиск альтернативных материалов для аугментационной цистопластики. Планируемые исследования позволят изучить в экспериментальных условиях возможность использования биомедицинского клеточного продукта в виде трехмерного композита для аугментации мочевого пузыря.Применение тканеинженерных конструкций для аугментации мочевого пузыря позволит избежать осложнения в донорской зоне, и минимизировать их непосредственно в области хирургического вмешательства. Это не только упростит ход хирургического вмешательства, но и улучшит качество жизни данной группы пациентов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На первом этапе, с привлечением инфраструктуры ФГБУН Институт цитологии РАН (ИНЦ РАН) созданы скаффолды, выделены и культивированы мезенхимные стволовые клетки, полученные из красного костного мозга кролика. Скаффолд был создан из поли-L,L,-лактида и фиброина шелка. Всего приготовлено 36 скаффолдов диаметром 4.2 (n=9), 5.3 (n=9), 6.1(n=9), 6.7(n=9) см для замещения объема мочевого пузыря на 5, 10, 15 и 20 мл соответственно. Кроме того, в условиях in vitro произведены замеры их механической прочности и эластичности, которые оказались удовлетворительными. Клетки культивировали в течение трех недель с использованием специальных питательных сред. Далее для последующей идентификации клеток в эксперименте in vivo МСК были мечены суперпарамагнитными наночастицами оксида железа (Fe3O4, SPION). Меченные наночастицами МСК (2×10^6/мл в 400 мкл среды) введены в приготовленные скаффолды. Оценку адгезии клеток осуществляли с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS100, Япония. С помощью электронной микроскопии изучена ультраструктурная организация клеток, находящихся внутри 3D скаффолда, оценка функционального состояния клеток. В экспериментальной лаборатории ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России начато выполнение второго этапа исследования. 6 интактным животным выполнена цистометрия наполнения с использованием физиологического раствора комнатной температуры. Инфузия через уретральный уродинамический катетер Ch № 6 со скоростью 5 мл/мин, синхронная регистрация абдоминального давления – через ректальный датчик. Максимальная цистометрическая емкость составила 11,2±0,97 мл, на этом объеме зафиксировано сокращение детрузора с потоком мочи по уретре мимо катетера. Интравезикальное давление в момент начала потока мочи – 26,03±3,2 см вод. ст., максимальное значение – 38,26±3,48 см вод. ст. Мочевой пузырь опорожнен полностью. Синхронно с цистометрией проведена запись ЭМГ с поверхностными электродами: регистрируется постепенное увеличение ЭМГ-активности по мере наполнения мочевого пузыря. У этих же 6 животных измерена анестетическая емкость мочевого пузыря путем инфузии через уретральный катетер Ch № 8 под давлением 20 см водного столба. Анестетическая емкость составила 23,83±0,71 мл, на этом объеме зафиксировано прекращение тока раствора. Выполнена аугментационная цистопластика тканенженерным резервуаром у 18 лабораторных животных. на данный момент выполнено замещение объема мочевого пузыря на 5 мл (n=9) и на 10 мл (n=9). Получены предварительные результаты. По данным компьютерной томографии органов брюшной полости и малого таза (нативное исследование и с внутрипузырным введением рентгенконтрастного вещества) через 4 недели после оперативного вмешательства определяется мочевой пузырь физиологической емкости (10-11 мл), имплантированная конструкция визуализируется в виде гиперинтенсивного сигнала в области верхушки мочевого пузыря. затеков контрастного вещества не определяется. Выведены из эксперимента 3 животных, перенесших замещение части мочевого пузыря объемом 5 мл. Период наблюдения составил 4 недели. Макроскопически зона анастомоза состоятельна, тканеинженерная конструкция определяется в месте имплантации. Препараты подготовлены для гистологического исследования и конфокальной микроскопии срезов в зоне имплантации. Предварительные результаты доложены на Симпозиуме «Корневские чтения. Практические и фундаментальные решения новых вызовов» в рамках XI-го Конгресса «Национальной Ассоциации Фтизиатров», Санкт-Петербург, 24-25 ноября 2022 г. (устный доклад) и V Национального конгресса по регенеративной медицине, Москва, 23-25 ноября 2022 г. (постерная сессия). По теме проекта опубликована одна статья в журнале, индексируемом в базах данных «Скопус» (Scopus) и РИНЦ, принята к печати одна статья в журнал, индексируемый в базе данных РИНЦ, А также одна статья принята к печати в журнале, индексируемых в базах данных «Скопус» (Scopus), RSCI и РИНЦ на 2023 год.

Публикации

1. Муравьев А.Н., Орлова Н.В., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Виноградова Т.И., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Яблонский П.К. Возможности тканевой инженерии и клеточных технологий в коррекции патологии органов мочевыделительной системы: анализ литературы и собственный опыт Медицинский альянс, - (год публикации - 2022)

2. Орлова Н.В., Муравьев А.Н., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Виноградова Т.И., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Горбунов А.И., Лебедев А.А., Горелов А.И., Яблонский П.К. Mesenchymal stem cells in complex treatment of urinary tract diseases: a literature review and our own experience Cellular Therapy and Transplantation, 12 (1) (год публикации - 2023) https://doi.org/10.18620/ctt-1866-8836-2023-12-1-51-59

3. Орлова Н.В., Муравьев А.Н., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Виноградова Т.И., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Яблонский П.К. Возможности применения аллогенных тканеинженерных продуктов в экспериментальной реконструкции мочевого пузыря Молекулярная медицина, 20 (6): 44–49. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.29296/24999490-2022-06-07

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Первый этап проведен на базе ФГБУН Институт цитологии РАН (ИНЦ РАН). МСК кролика выделены и культивированы по стандартной методике после трепан-биопсии из гребня подвздошной кости. Для последующей визуализации в цитоплазму клеток введены суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (Fe3O4, SPION). В качестве скаффолда использовались матрица из поли-L,L,-лактида и фиброина шелка (данная конструкция признана оптимальной на основании предшествующих экспериментов). Всего приготовлено 36 скаффолдов для замещения объема мочевого пузыря на 5, 10, 15 и 20 мл соответственно. В подготовленные тканеинженерные конструкции (ТИК) введены меченые клетки. В экспериментальной лаборатории ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России выполнен второй этап исследования. 6 интактным животным выполнена цистометрия наполнения с использованием физиологического раствора комнатной температуры. Инфузия через уретральный уродинамический катетер Ch № 6 со скоростью 3 мл/мин, синхронная регистрация абдоминального давления – через ректальный датчик. Максимальная цистометрическая емкость составила 11,2±0,97 мл. У этих же 6 животных измерена анестетическая емкость мочевого пузыря путем инфузии через уретральный катетер Ch № 8 под давлением 20 см водного столба. Анестетическая емкость составила 23,83±0,71 мл. Выполнена аугментационная цистопластика тканенженерным резервуаром у 36 лабораторных животных на 5 мл (n=9), 10 мл (n=9), 15 (n=9) и 20 (n=9) мл. Методика хирургического вмешательства: Под общей анестезией (комбинированный препарат для анестезии тилетамина гидрохлорид/золазепама гидрохлорид (Zoletil, Virbac SA, France) в дозе 25 мг/кг массы тела внутримышечно; миорелаксант ксилазина гидрохлорид (рометар, Bioveta, Чехия) в виде 2% раствора в объеме 1,0-1,5 мл внутримышечно) через срединный лапаротомический разрез длиной 4 см выделен мочевой пузырь. Выполнена электромиография (ЭМГ) при помощи введения 2-х пар одноразовых подкожных нержавеющих игольчатых электродов (12 мм х 0.40 мм, Viasys, Santa Monica, CA, USA). После резекции участка мочевого пузыря мочевого пузыря выполнена фиксация тканеинженерного резервуара узловыми швами викрил 4-0. Операционная рана ушита послойно с оставлением цистостомического дренажа, выведенного под кожей на спину. Получены результаты. По данным МСКТ органов брюшной полости и малого таза с внутрипузырным введением рентгенконтрастного вещества через 4-8-12 недель после оперативного вмешательства определяется мочевой резервуар физиологической емкости. Затеков контрастного вещества не определяется. МСКТ выполняли после седации животных препаратами для анестезии тилетамина гидрохлорид/золазепама гидрохлорид. При этом определяли анестетическую емкость мочевого резервуара по описанной выше методике. Анестетическая емкость оказалась сравнимой с дооперационной во всех группах наблюдения и составила 20,15±0,61 мл. Цистометрия наполнения, выполненная животным всех групп на сроках 4-8-12 недель подтвердила корреляцию значений физиологической емкости сформированного резервуара с дооперационными показателями. У 2 животных, перенесших субтотальное замещение замещение (20 мл объема) мочевого пузыря через 12 недель выполнена открытая ЭМГ перед выведением из эксперимента. ЭМГ-мониторинг стенки МП при наполнении выявил низкоамплитудную электрическую активность во время индуцированного мочеиспускания на 7-10 секунде, длительность и магнитуда существенно ниже таковой у интактных животных. Все 36 животных выведены из эксперимента. Период наблюдения составил 4-8-12 недель (по 3 животных из каждой группы на каждый срок наблюдения). Макроскопически зона анастомоза состоятельна во всех группах животных, к 12 неделе наблюдения отмечается лизис ТИК с сохранением небольших остаточных фрагментов. Препараты исследованы гистологически. При этом показано, что к 3 месяцам наблюдения ТИК прорастает стромальной тканью с новообразованными сосудами, происходит активация фибробластов, миофибробластов, эндотелия, что сопровождается воспалительным инфильтратом. Присутствует грануляционная ткань разной степени зрелости. В срезах около зоны анастомоза определяются пучки дезорганизованных мышечных волокон, пучки миофибробластов. Данный опыт показал возможность субтотального замещения мочевого пузыря кролика тканеинженерным резервуаром, сохранив при этом анатомическую и функциональную целостность органа. У оперированных животных наблюдается сохранение функциональной емкости мочевого пузыря, сравнимое с таковой у интактных кроликов. Лучевые методы обследования показали анатомическую целостность сформированного тканеинженерного резервуара. Кроме того, в течение 12 недель после оперативного вмешательства не отмечено значимой воспалительной реакции и признаков отторжения имплантата. Однако макро- и микроскопическое исследование показало, что данного срока наблюдения недостаточно для полного лизиса тканеинженерной конструкции, что требует проведения дальнейших исследований и оценки более долгосрочных результатов. Результаты доложены на 3 научных конференциях с международным участием, проведен мастер-класс по экспериментальным исследованиям и разработкам для молодых ученых. По теме проекта нарастающим итогом опубликовано 2 статьи в различных научных журналах, две статьи приняты к печати на 2023 и 2024 годы.

Публикации

1. Орлова Н.В., Муравьев А.Н., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Виноградова Т.И., Маслак О.С., Богданова Е.О., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Горбунов А.И., Яблонский П.К. Субтотальное замещение мочевого пузыря тканеинженерными конструкциями с использованием аллогенных мезенхимных клеток в эксперименте Медицинский альянс, - (год публикации - 2023)

2. Орлова Н.В., Муравьев А.Н., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Горбунов А.И., Виноградова Т.И., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Маслак О.С., Гаврилов П.В., Яблонский П.К. Экспериментальная реконструкция мочевого пузыря аллогенными тканеинженерными конструкциями различного объема Научное издание 100-летие Пермского медицинского журнала Материалы конференции с международным участием, посвященной 100-летию «Пермского медицинского журнала» (г. Пермь, 23 сентября 2023 г.), 100-летие Пермского медицинского журнала : статья в сборнике трудов конф. с международ. участием, посвященной 100-летию «Пермского медицинского журнала» (г. Пермь, 23 сентября 2023 г.). – Пермь, 2023. – С. 257-260. ISBN 978-5-398-03010-5 (год публикации - 2023)

3. Орлова Н.В., Муравьев А.Н., Горелова А.А., Ремезова А.Н., Горбунов А.И., Виноградова Т.И., Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Яблонский П.К. Экспериментальное замещение различных объемов мочевого пузыря аллогенными тканеинженерными конструкциями Молекулярная медицина, - (год публикации - 2024)

4. Горелова А.А., Ремезова А.Н., Андреев А.М. Пластика мочевого пузыря с применением тканеинженерной конструкции (экспериментальное исследование). Предварительные результаты Научное издание Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье. – Том XXVI, Статья в сборнике трудов конференции. Научное издание Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье. – Том XXVI. Санкт-Петербург, 2023. С. 798-799 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.32415/scientia_978-5-6049390-4-8

Возможность практического использования результатов
Одной из приоритетных научных проблем Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации является создание биомедицинских тканеинженерных продуктов на основе биодеградируемых полимеров. Разработка предлагаемого проекта направлена, в первую очередь, на решение проблем биосовместимости биодеградируемых полимерных основ, что при внедрении в клиническую практику существенно отразится на повышении качества жизни населения и укреплении позиции России в глобальном рейтинге уровня жизни за счет создания на основе передовых научных исследований востребованных продуктов, товаров и услуг. Проект соответствует поставленным в Стратегии НТР РФ целям по импортозамещению и локализации производств товаров в Российской Федерации. Конструкции для тканеинженерной реконструкции мочевого пузыря разрабатываются несколькими коллективами в разных странах (США, Китай, Германия, Япония, Южная Корея). Активация подобной работы при поддержке Фонда позволит создать условия для опережающего внедрения отечественных разработок и импортозамещения. Особенности технологии приготовления продукта позволят создать его производство полного цикла на территории Российской Федерации. Производство биомедицинских клеточных продуктов и биополимерных матриц является новой отраслью. Масштабирование подобных технологий потребует создания новых рабочих мест и привлечения молодых высококвалифицированных специалистов клеточных биологов и химиков, врачей. Выполнение проекта способствует реализации задач в Стратегии НТР, связанных с развитием современной системы научно-технического творчества молодежи и созданием рабочих мест в высокотехнологичных отраслях экономики. Таким образом можно утверждать, что создание первого в классе инновационного биомедицинского клеточного продукта для замещения мочевого пузыря полностью соответствует Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации, а его выполнение будет способствовать реализации целевых показателей.