Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект посвящен изучению потенциального антифибротического действия полифенольной композиции BP-C3, обладающей доказанными геропротекторными и противовоспалительными свойствами. По плану первого года реализации проекта проведены исследования in vitro на культуре клеток фибробластов легкого эмбриона человека, а также исследования in vivo на модели блеомицин-индуцированного фиброза у мышей линии С57bl/6, в том числе в комбинации с введением TNFa, вызывающего системное воспаление у мышей. Эксперимент in vitro с использованием прибора xCELLigence показал дозозависимое антипролиферативное воздействие композиции BP-C3 на культуру фибробластов легкого эмбриона человека; наилучший результат (двухкратное снижение пролиферативной активности) был получен для концентрации препарата 0,1%. Был проведен пилотный опыт in vivo для уточнения дозы и режима введения TNFa мышам C57bl/6, в котором использовали 25 мышей самок, по результатам которого для индукции системного воспаления была выбран режим применения TNFa в течение 5 дней в дозе 125 мг/кг 2 раза в день. Этот режим обеспечивал устойчивое повышение содержания лейкоцитов, но не сопровождался существенной потерей массы экспериментальных животных или их гибелью. Была проведена оценка потенциального антифибротического действия ВР-С3 на модели блеомицин-индуцированного фиброза у мышей, в том числе с системным воспалением. В исследование были включены 70 мышей-самок линии С57bl/6 в возрасте 3 месяца. Животные были разделены на следующие 7 групп по 10 животных в каждой после рандомизации по массе тела: 1. Контроль. Животным вводили плацебо – физиологический раствор – 0,1 мл внутрибрюшинно (в/б) дважды в день с -4 по -1 день опыта, затем дважды в неделю с 0 дня опыта в течение 4 недель. 2. Блеомицин (БЛ) – контроль фиброза. Животным вводили блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю в течение 4 недель. 3. TNFa – индуцированное системное воспаление. Животным вводили TNFa 125 мкг/кг в/б дважды в день с -7 по -4 день опыта. 4. БЛ + TNFa – индуцированное системное воспаление + фиброз. Животным вводили TNFa 125 мкг/кг в/б дважды в день с -7 по -4 день опыта, затем блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю в течение 4 недель. 5. БЛ + BP-C3 – введение полифенольного препарата на фоне индукции фиброза. Животные получали блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю и 80 мг/кг BP-C3 п/о с 0 дня опыта ежедневно в течение 4 недель. 6. Системное воспаление+BP-C3. Животные получали TNFa 125 мкг/кг в/б дважды в день с -7 по -4 день и BP-C3 в дозе 80 мг/кг п/о с -7 по -1 день опыта ежедневно. 7. Системное воспаление+фиброз+ BP-C3. Животные получали TNFa 125 мкг/кг в/б дважды в день с -7 по -4 день опыта, BP-C3 в дозе 80 мг/кг п/о с -7 дня и до окончания опыта, затем блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю в течение 4 недель. В течение опыта за животными вели ежедневное наблюдение, дважды в неделю мышей взвешивали. На 0 сутки, 18 сутки и при завершении опыта брали периферическую кровь из кончика хвоста для проведения клинического анализа. За сутки до эвтаназии для оценки пролиферации мышам ввели 5-этинил-2'-деоксиуридин (EdU, аналог тимидина), который встраивается в ДНК в S-фазе клеточного цикла. На 35 сутки опыта мышей подвергли эвтаназии путем декапитации с терминальным взятием крови для определения цитокинов и показателей антиоксидантной системы. После эвтаназии животных немедленно вскрывали, брали бронхо-альвеолярный лаваж, выделяли легкие и другие внутренние органы, взвешивали и фиксировали в 10% формалине для патоморфологического анализа. Выявлено, что введение блеомицина вызывает снижение массы тела экспериментальных животных, при этом введение TNFa или полифенольной композиции ВР-С3 не влияет на общую токсичность блеомицина. Клинический анализ периферической крови экспериментальных животных показал, что введение ВР-С3 способствует снижению содержания лейкоцитов и гранулоцитов, которое возрастает на разных сроках под влиянием TNFa и/или блеомицина. Оценка содержания цитокинов провоспалительного спектра в сыворотке крови показала, что эффект от введения экзогенного TNFa сохраняется через 35 дней от окончания его введения; продемонстрировано нормализующее влияния исследуемого полифенольного препарата. Были получены данные о влиянии фиброза, системного воспаления и введения BP-C3 на активность каталазы и СОД, а также содержание МДА в лизате эритроцитов периферической крови. Показано, что развитие вызванного блеомицином фиброза легкого приводило к окислительному стрессу и снижению уровня активности каталазы и СОД. TNFa также способствовал некоторому снижению активности антиоксидантной системы, главным образом активности СОД. ВР-С3 способствовал некоторому повышению активности каталазы и СОД и снижению уровня МДА. Дополнительно к изначальному плану исследования, были получены данные о содержании гилроксипролина в образцах бронхо-альвеолярного лаважа экспериментальных животных. Показано, что развитие блеомицин-индуцированного фиброза легкого приводило в активации процессов синтеза и распада коллагена, что подтверждалось повышением концентрации как свободного, так и связанного с белком гидроксипролина, а применение полифенольного препарата несколько снижало эти показатели. Патоморфологическая оценка препаратов легкого экспериментальных животных показала, что у животных, получавших блеомицин, обнаруживались фибротические изменения, которые сопровождались выраженной воспалительной реакцией. При этом TNFа не оказывал собственного профибротического действия, а препарат ВР-С3 приводил к частичной нормализации структуры легкого. Данные также подтверждаются результатами оценки площади коллагенового матрикса и клеток, экспрессирующих aSMA. Так, введение мышам ВР-С3 на фоне введения блеомицина и его комбинации с TNFa приводило к снижению содержания гладкомышечного актина на 27% в группе БЛ+ВР-С3 по сравнению с БЛ (p<0,05) и на 30% в группе БЛ+TNFa+ВР-С3 по сравнению с БЛ+TNFa (p<0,05). Полученные данные согласуются с результатами оценки пролиферации в ткани легкого. Наибольшая доля ядер в S-фазе клеточного цикла, которые выявляли по включению ЕдУ, была выявлена у животных, получавших блеомицин и его комбинацию с TNFa. В свою очередь, ВР-С3 способствовал снижению доли синтезирующих ДНК клеток. Криоконсервированные ткани легких подготовлены для оценки распределения сфинголипидов в ткани легкого. Начат эксперимент следующего года на пожилых животных. 80 мышей-самок рандомизированы на две когорты – интактные и получающие BP-C3 в дозе 15 мг/кг начиная с возраста 3 месяцев. Таким образом, результаты работы первого года исследования показали, что препарат BP-CЗ снижал уровень пролиферации фибробластов in vitro и клеток легкого in vivo, а также уменьшал тяжесть фиброза и продукцию провоспалительных цитокинов у мышей. Также обнаружено положительное влияние на состояние антиоксидантной системы крови и синтез коллагена в легких. План исследования выполнен полностью. Дополнительно выполнено исследование бронхо-альвеолярного лаважа. Все заявленные результаты первого года исследования получены.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Второй год проекта был посвящен изучению потенциального антифибротического действия полифенольной композиции BP-C3 у стареющих животных при лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом введении полифенольного препарата, а также сравнению полученных результатов с результатами опыта 1 года на молодых животных. В исследование были включены 60 мышей-самок линии С57bl/6 в возрасте 12-13 месяцев. Половина животных получала BP-C3 в дозе 15 мг/кг ежедневно п/о начиная с возраста 3 месяца и до 0 дня опыта. Животные были разделены на следующие 6 групп по 10 животных в каждой после рандомизации по массе тела: 1. Контроль (плацебо 0,1 мл в/б дважды в неделю с 0 дня опыта в течение 4 недель) 2. БЛ (блеомицин 20 мг/кг с 0 дня опыта в/б дважды в неделю в течение 4 недель) 3. БЛ+ BP-C3 - ВР-С3 в лечебном режиме (блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю и ВР-С3 в дозе 80 мг/кг п/о с 0 дня опыта в течение 4 недель) 4. Контроль BP-C3 в профилактическом, затем лечебном режиме (BP-C3 15 мг/кг ежедневно п/о начиная с возраста 3 месяца и до 0 дня опыта, затем 80 мг/кг п/о с 0 дня опыта в течение 4 недель) 5. BP-C3+БЛ - ВР-С3 в профилактическом режиме (блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю и BP-C3 15 мг/кг ежедневно п/о начиная с возраста 3 месяца и до 0 дня опыта) 6. BP-C3+БЛ+BP-C3 - фиброз и ВР-С3 в профилактическом, затем лечебном режиме (блеомицин 20 мг/кг в/б с 0 дня опыта дважды в неделю и BP-C3 как в группе 4). В течение опыта за животными вели ежедневное наблюдение, дважды в неделю мышей взвешивали. На 0 сутки, 18 сутки и при завершении опыта брали периферическую кровь из кончика хвоста для проведения клинического анализа. За сутки до эвтаназии мышам ввели 5-этинил-2'-деоксиуридин (EdU, аналог тимидина), который встраивается в ДНК в S-фазе клеточного цикла, для оценки пролиферации. На 35 сутки опыта мышей подвергли эвтаназии путем декапитации с терминальным взятием крови для определения цитокинов и показателей антиоксидантной системы. После эвтаназии животных вскрывали и выделяли легкие и другие внутренние органы, которые взвешивали. Легкие разделяли на доли, доли правого легкого замораживали в жидком азоте для последующего определения гидроксипролина, пространственного распределения сфинголипидов и оценки активности бета-галактозидазы. Левое легкое фиксировали в формалине для патоморфологических исследований. Показано, что введение блеомицина вызывает снижение массы тела экспериментальных животных, при этом введение полифенольной композиции ВР-С3 не влияет на общую токсичность блеомицина. Клинический анализ крови экспериментальных животных показал, что длительное введение ВР-С3 в отсутствие других воздействий на животных не оказывало влияния на гемопоэз. Введение блеомицина вызывало снижение содержания моноцитов в крови, а применение ВР-С3 в лечебном и лечебно-профилактическом способствовало нормализации содержания моноцитов. Был проведен анализ цитокинов провоспалительного спектра, IL-10, имеющего плейотропные свойства, противовоспалительного цитокина IL12, а также колониестимулирующего фактора GM-CSF. Выявлено, что введение ВР-С3 вызывает снижение содержания цитокинов провоспалительного спектра (IFN-g, TNF-a), а также повышение содержания GM-CSF, которое может обусловливать защитное влияние на моноцитарный росток кроветворения. Был проведен анализ содержания гидроксипролина в образцах гомогената легкого экспериментальных животных. Показано, что развитие индуцированного блеомицином фиброза легкого приводит к активации процессов синтеза коллагена и ремоделирования межклеточного матрикса, что подтверждалось повышением концентрации свободного и связанного с белком гидроксипролина, а применение полифенольного препарата несколько снижало эти показатели. Патоморфологическая оценка фибротических изменений легкого экспериментальных животных показала, что у всех животных, получавших блеомицин, развивались фибротические изменения, которые сопровождались воспалительной реакцией. Применение препарата ВР-С3 в лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом режиме приводило к частичной нормализации структуры легкого. Результаты оценки содержания гидроксипролина в ткани и оценки морфологических изменений структуры легкого согласуются с результатами оценки относительной площади коллагенового матрикса (окрашивание трихромом по Массону) и клеток, экспрессирующих гладкомышечного актина (аSMA). Так, введение мышам ВР-С3 на фоне введения блеомицина, в профилактическом и комбинированном режиме приводило к снижению доли коллагенового матрикса в ткани на 21-23% по сравнению с БЛ (p<0,05). Содержание аSMA при развитии фиброза легкого повышалось практически в 3 раза по сравнению с контролем, а введение ВР-С3 в лечебном и лечебно-профилактическом режиме приводило к статистически значимому снижению доли иммунопозитивной ткани на 32 % (p<0,01). Полученные данные также подтверждаются результатами оценки пролиферации в ткани легкого. Наибольшая доля ядер в S-фазе клеточного цикла была выявлена у животных, получавших блеомицин, а введение ВР-С3 вызывало некоторое снижение доли синтезирующих ДНК клеток. Был проведен анализ содержания липидов в легких. Показано, что при индукции фиброза снижается содержание церамидов в ткани. При этом применение полифенольного препарата в лечебном и лечебно-профилактическом режиме у животных с фиброзом, а также у контрольных животных без фиброза повышало их содержание в ткани легкого. Также показан положительный эффект ВР-С3 на уровень сфингомиелинов во всех группах животных, которые получали препарат. Таким образом, препарат BP-CЗ снижал выраженность фиброза легкого, содержание коллагенового матрикса, экспрессию маркера миофибробластов аSMA и продукцию провоспалительных цитокинов. Также обнаружено положительное влияние на состояние антиоксидантной системы организма и содержание церамидов и сфинголипидов в ткани легкого. Был проведен сравнительный анализ показателей, изучавшихся в опытах 1 и 2 года in vivo. Ожидалось, что у стареющих животных фибротические изменения в ткани легкого будут более выражены, а старение повлияет на показатели антиоксидантной системы и содержание в крови провоспалительных цитокинов. Было обнаружено, что показатели, изученные в ходе патоморфологических исследований ткани легкого, значимо не различались у молодых и старых животных контрольных групп, а введение блеомицина оказывало сравнимый эффект на содержание коллагенового матрикса, экспрессию aSMA и пролиферацию в легком. Более того, в опыте второго года эти показатели в группах животных, получавших только блеомицин, были немного ниже, чем в опыте на молодых мышах. Таким образом, старение либо не влияет на чувствительность к блеомицину, либо несколько ее снижает. Результаты согласуются с данными, полученными в опыте первого года, когда мышам для индукции системного воспаления, одного из признаков старения, вводили экзогенный TNFa. В этом опыте было показано, что этот фактор не повышает чувствительность животных профибротическому действию блеомицина. Было показано, что у молодых и старых животных блеомицин вызывает отличающиеся изменения показателей периферической крови. У стареющих животных введение блеомицина не приводило к повышению числа гранулоцитов в крови, в отличие от молодых, что свидительствует о менее выраженной воспалительной реакции. Это может быть связано со снижением иммунного ответа, вызванного старением. Также у старых мышей введение блеомицина вызывало снижение содержания моноцитов в крови, которого не наблюдалось в опыте 1 года. Вероятно, у молодых животных клетки-предшественники моноцитов более устойчивы к этому цитостатику. Все заявленные результаты второго года исследования получены. За отчетный период опубликовано 3 статьи, из них две – индексируемые в базах данных WoS, Scopus и RSCI, и одна – в журнале, индексируемом в иной международной базе данных, а также представлены на онкофоруме «Белые ночи»