Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках первого года выполнения Проекта были сконструированы плазмиды для сверхпродукции рекомбинантных белков OmpC и OmpF Salmonella enteritidis и Escherichia coli. Были получены трансформированные плазмидами клетки E. coli для сверхпродукции всех четырёх белков OmpC и OmpF. Далее наличие сверхпродукции подтверждали Вестерн-блот гибридизацией. Гибридизация полученной мембраны с использованием антител против специального концевого участка белков, состоящего из последовательности шести гистидинов, дала противоречивый результат – к сожалению, на мембране виден бенд только одного из четырёх белков – OmpF Salmonella enteritidis. Это можно объяснить, например, тем, что любой белок проходит стадию фолдинга (упаковки) и концевой участок может быть «спрятан» внутри белка и оказаться недоступным для эпитопов антител. С другой стороны, все пробы, которые наносятся на гель, проходят инкубацию с детергентами (в данном случае SDS, 2% додецил-сульфатом натрия), которые также способны изменить не только заряд молекул белка, но и существенно влияют на их фолдинг. Положительный результат дало применение специфичных к данным белкам антител кролика. Убедившись в достоверности результатов – целевые белки соответствуют теоретическим данным по массе, хороший уровень индукции – перешли к препаративной наработке белков OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis с использованием аффинной хроматографии. Очищенные рекомбинантные белки OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis были использованы для проверки способности этими белками образовывать фибриллярные агрегаты in vitro через растворение лиофилизированного белка в растворе HFIP (hexafluoro-2-propanol, гексафторизопропанол) с последующим выпариванием в потоке азота. С использованием просвечивающей электронной микроскопии было показано, что все исследуемые белки in vitro образуют крупные неразветвленные фибриллы, имеющие видимую исчерченность. Одним из характерных свойств амилоидов является их высокая устойчивость к обработке ионными детергентами и протеазами. При комнатной температуре агрегаты большинства амилоидных белков остаются стабильными в растворах ионных детергентов (или частично деградируют до олигомеров), но при кипячении разрушаются до мономеров и беспрепятственно входят в полиакриламидный гель (SDS-PAGE), что можно проверить при помощи неспецифичной тотальной окраски белков или посредством Вестерн-блот гибридизации с использованием антител. В итоге, стоит отметить, что полученные ранее специфичные к анализируемым белкам антитела распознают не только соответствующие фибриллы, но и олигомерные фракции. Разрушение высокомолекулярных агрегатов в присутствии ионных детергентов при кипячении и их устойчивость в холодных условиях – ещё один фактор, подтверждающий амилоидные свойства полученных нами в данной работе фибрилл белков OmpC и OmpF. Также нами исследовано действие трипсина и муравьиной кислоты на агрегаты OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis in vitro. Оказалось, что исследуемые фибриллы проявляют сильную устойчивость к воздействию трипсина, тогда как при обработке муравьиной кислотой демонстрируют растворение полимерной фракции, находящейся в лунках. Чтобы подтвердить амилоидные свойства изучаемых агрегатов, мы исследовали их взаимодействие с красителями тиофлавином Т и Конго красным. Полученные фибриллы OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis проявляют амилоидные свойства ввиду i) взаимодействия с красителем Конго красный, который при связывании с амилоидами даёт жёлто-зелёное двойное лучепреломление в поляризованном свете; ii) связывания с красителем Тиофлавином Т. В целом, серия описанных экспериментов продемонстрировала, что полученные in vitro фибриллы OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis проявляют все ключевые характеристики амилоидов, что создает основы для последующего анализа (второй год выполнения Проекта) связи амилоидогенеза поринов с вирулентностью бактерий in vivo. В то же время, детальное изучение особенностей амилоидогенеза поринов представляет собой сложную задачу, требующую оптимизации методологии исследования, для чего был разработан и протестирован новый подход к обработке данных динамического светорассеяния с использованием агрегатов известных модельных амилоидов (результаты опубликованы в статье в журнале European Biophysics Journal, https://link.springer.com/article/10.1007/s00249-022-01600-5#Abs1). В отчётный период результаты Проекта были представлены на трёх конференциях, в том числе с устным выступлением руководителя Проекта Белоусова М.В. в Белграде (Сербия), а также на одной он-лайн конференции Experimental Biology 2022 (постерный доклад), результаты которой опубликованы в журнале FASEB Journal: 1. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Sulatskaya A.I., Sulatsky M.I., Antonets K.S, Nizhnikov A.A. OmpC porins of Salmonella enterica and Escherichia coli possess amyloid-forming properties // FEMS Conference on Microbiology in association with Serbian Society of Microbiology (30 June - 2 July 2022, Belgrade, Serbia), P.92-93. 2. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Sulatskaya A.I., Sulatsky M.I., Antonets K.S, Nizhnikov A.A. OmpF porins of Enterobacteriaceae possess amyloidogenic properties // FASEB Journal, 2022, V.36, Issue S1 (Supplement: Experimental Biology 2022 Meeting Abstracts, 2-5 April 2022, USA), P.1-1. doi: 10.1096/fasebj.2022.36.S1.L7850 (Impact Factor WoS 5.191, Q1 / Impact Factor Scopus 1.71, Q1) 3. Фаюд Х., Косолапова А.О., Антонец К.С., Нижников А.А. Выявление амилоидогенных белков в протеоме Salmonella enteritidis var. Issatschenko // Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (22-23 июня 2022, Санкт-Петербург, Россия), с. 32. Публикация по результатам выполнения первого года выполнения Проекта (2022 г.): 1. Sokolov P.A., Rolich V.I., Vezo O.S., Belousov M.V., Bondarev S.A., Zhouravleva G.A., Kasyanenko N.A. Amyloid fibril length distribution from dynamic light scattering data // European Biophysics Journal, 2022, V. 51(4-5), P. 325-333. DOI: 10.1007/s00249-022-01600-5 (Impact Factor WoS 1.733, Q3 / Impact Factor Scopus 0.43, Q3)

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках второго года выполнения проекта впервые было показано, что четыре белка внешней мембраны: OmpC E. coli и S. enterica, OmpF E. coli и S. enterica образуют in vitro фибриллы, обладающие всеми основными свойствами амилоидов: устойчивостью к детергентам и протеазам, специфическими эффектами при связывании с красителями конго красным (КК) и тиофлавином Т (ТфТ), типичной для амилоидов картиной при рентгеновской дифракции, высоким содержанием β-листов. Также все четыре белка, согласно предсказанию программы AmyPred2, имеют большие потенциально амилоидогенные области, расположенные внутри домена β-бочонка. Нами было установлено, что изученные порины Omp образуют амилоиды при секреции на поверхность клеток E. coli в системе C-DAG (curli-dependent amyloid generator system). В результате этого эксперимента мы обнаружили, что секреция на поверхность бактериальных клеток всех анализируемых белков OmpC и OmpF из E. coli и S. enterica, слитых с N-терминальным пептидом, обеспечивающим секрецию в специальном штамме VS39 E. coli, имеет одинаковое фенотипическое проявление: оранжевую окраску колоний на чашке с культуральной средой, содержащей КК. Микроскопия колоний в поляризованном свете подтвердила это наблюдение: колонии VS39, секретирующие различные порины Omp, содержали конгофильные включения, которые, в отличие от отрицательного контроля (клетки VS39, секретирующие растворимый белок Sup35M), демонстрировали двойное лучепреломление в поляризованном свете. Исследование колоний с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) подтвердило образование амилоидных фибрилл клетками VS39, секретирующими все четыре Omp: эти клетки, в отличие от отрицательного контроля, содержали длинные тонкие фибриллы на своей поверхности. Далее, чтобы изучить эффекты сверхпродукции OmpC и OmpF в E. coli и S. enterica в штаммах E. coli, мы сконструировали серию плазмид, содержащих гены, кодирующие полноразмерные немеченые Omp с эндогенными N-концевыми сигнальными пептидами под контролем IPTG (изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид)-индуцируемый промотор. Мы произвели сверхпродукцию OmpC и OmpF E. coli и S. enterica в штамме E. coli BL21 (DE3) и проанализировали эффекты их сверхпродукции. Мы обнаружили, что сверхпродукция всех четырех поринов Omp вызывает умеренный конгофильный фенотип (колонии, сверхпродуцирующие OmpF, имеют более яркий цвет, чем колонии, сверхпродуцирующие OmpC) на индуцибельной среде YESCA с добавлением КК, что указывает на образование агрегатов белка. Более того, исследование колоний с помощью микроскопии в поляризованном свете выявило увеличение образования конгофильных включений с двойным лучепреломлением, что указывает на индукцию образования амилоидов за счет сверхпродукции всех четырех белков. Изучение образцов с использованием ПЭМ не продемонстрировал какого-либо увеличения образования фибрилл на поверхности клеток E. coli для всех проанализированных поринов Omp, что указывает на то, что включения, содержащие эти белки, расположены отдельно во внеклеточном пространстве. Далее, анализ жизнеспособности клеток, проведенный с помощью МТТ (по восстановлению желтой соли тетразолия), показал, что все четыре варианта фибрилл вызывают статистически значимые эффекты токсичности на клетки млекопитающих. Примечательно, что фибриллы OmpC E. coli и S. enterica показали одинаковую токсичность, тогда как фибриллы OmpF E. coli были более токсичными, чем фибриллы, образованные его ортологом из S. enterica. Однако фибриллы OmpC E. coli менее токсичны, чем фибриллы OmpF E. coli; этот эффект является кумулятивным и лучше заметен по истечении 48 часов. Наконец, изучили агрегацию поринов OmpC и OmpF в клетках сальмонеллы уже в нативных условиях in vivo. Мы сравнили фенотипы штаммов E. coli BL21 (DE3) и S. enterica, использованных в этом исследовании, на среде YESCA с добавлением КК с разными значениями pH: 7,5 и 9,0. Мы обнаружили, что в отличие от E. coli BL21 (DE3) S. enterica проявляет конгофильный фенотип, который более выражен на чашках с pH 9,0, где по периферии колоний происходит сильное накопление КК. Микроскопия в поляризованном свете показала, что культуры S. enterica, выращенные в двух условиях pH, содержат амилоидные включения, дающие двойное лучепреломление. Как и в случае сверхпродукции поринов Omp в клетках E. coli BL21 (DE3), с помощью ПЭМ мы не обнаружили увеличения образования фибрилл непосредственно на поверхности клеток S. enterica, выращенных ни при рН 7,5, ни при pH 9,0. Таким образом, S. enterica в нативных условиях продуцирует внеклеточные амилоидные структуры, что было нами подтверждено с помощью иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ПЭМ). Далее мы решили посмотреть другие амилоидные свойства поринов OmpC и OmpF S. enterica, образовавшихся в нативных условиях in vivo. Так OmpC, как и OmpF, полученные из образцов S. enterica, выращенных при разных значениях pH, присутствуют в устойчивой к детергентам агрегатной фракции в нативных условиях, что согласуется с данными, полученными ранее на E. coli. Эти агрегаты устойчивы к обработке додецилсульфату натрия при комнатной температуре, но растворяются при кипячении. Более того, агрегаты, содержащие OmpC и OmpF, полученные из образцов S. enterica, выращенных при разных значениях pH, проявляют устойчивость к обработке трипсином. Таким образом, OmpC и OmpF способны переходить в амилодоподобные агрегированные состояния как при сверхпродукции, так и в нативных условиях in vivo. В отчётный период результаты проекта были очно представлены на трёх конференциях (с устным выступлением руководителя Проекта Белоусова М.В. в Бишкеке, Киргизия и в Уфе, а также постером исполнителя Проекта Фаюд Х. в Санкт-Петербурге, Россия): 1) Belousov M.V., Kosolapova A.O., Sulatskaya A.I., Sulatsky M.I., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. OmpC and OmpF porins of Salmonella enterica and Escherichia coli possess amyloid-forming properties // International Symposium on Microorganisms and the Biosphere MICROBIOS-2023 (15-16 June 2023, Bishkek, Kyrgyzstan), P. 75. 2) Belousov M.V., Kosolapova A.O., Sulatsky M.I., Tsyganova A.V., Sulatskaya A.I., Bobylev A.G., Shtark O.Y., Tsyganov V.E., Volkov K.V., Antonets K.S., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Amyloid properties of outer membrane porins of Proteobacteria // X Съезд общества физиологов растений России «Биология растений в эпоху глобальных изменений климата» (18-23 сентября 2023, Уфа, Россия), с. 411. 3) Фаюд Х., Белоусов М.В., Антонец К.С., Нижников А.А. Амилоидные свойства белка Dps Salmonella enteritidis var. Issatschenko // II Всероссийская школа-конференция «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (26-27 июня 2023, Санкт-Петербург, Россия), с. 88-89. 4) Нижников А.А., Белоусов М.В., Сулацкая А.И., Косолапова А.О., Сулацкий М.И., Антонец К.С. Порины энтеробактерий формируют амилоиды, секретируемые в везикулы наружной мембраны // II Всероссийская школа-конференция «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (26-27 июня 2023, Санкт-Петербург, Россия), с. 67-68. Публикация по результатам выполнения второго года выполнения Проекта (2023 г.): Belousov M.V., Kosolapova A.O., Fayoud H., Sulatsky M.I., Sulatskaya A.I., Romanenko M.N., Bobylev A.G., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. OmpC and OmpF outer membrane proteins of Escherichia coli and Salmonella enterica form bona fide amyloids // International Journal of Molecular Sciences, 2023, V. 24(21), 15522 DOI: 10.3390/ijms242115522 (Impact Factor WoS 5.6, Q1 / Impact Factor Scopus 1.15, Q1)