Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект нацелен на оптимизацию люциферин-люциферазной пары биолюминесцентной системы высших грибов путем разработки новых аналогов люциферина с улучшенными спектральными характеристиками, а также отбор генов люцифераз из светящихся грибов разных видов и подбор оптимальных пар люциферин-люцифераза с улучшенными спектральными характеристиками для разработки биоимиджинговых методов. Основными задачами за первый год работы по проекту стали: — Молекулярный дизайн по крайней мере п-аминозамещенных аналогов люциферина грибов с удлиненной системой сопряжения и по крайней мере пяти аналогов с гетероароматическими заместителями (например, хинолинов, пиридинов, бензотиофенов, кумаринов и других), — Молекулярный дизайн ряда соединений с различным расположением О-содержащих заместителей (не менее 5) — возможных ингибиторов люциферазы, — Разработка синтетического подхода для каждого из вышеперечисленных соединений, — Экспериментальная проверка разработанного подхода к синтезу аналогов. В результате проделанной за первый год работы мы провели подробный анализ существующих в литературе подходов к разработке новых люциферин-люциферазных пар, применяемых в биоимиджинге на примере биолюминесцентной системы D-люциферина. Далее мы осуществили апробацию люциферина грибов и его двух ранее полученных функциональных аналогов в сравнительном эксперименте по биомиджингу опухоли в модельных животных in vivo и продемонстрировали принципиальную возможность применения люциферина грибов и его аналогов для визуализации опухолевых процессов в живых тканях. На основании полученных данных мы определили оптимальные направления для модификации структуры люциферина грибов для получения аналогов с улучшенными спектральными характеристиками на основе имеющихся эмпирических данных. В результате был предложен ряд целевых соединений — новых аналогов люциферина грибов, содержащих п-аминозамещенные ароматические заместители, гетероароматические заместители, такие как пиридин, хинолин, бензотиофен и кумарины (список из пятнадцати соединений). Для всех предложенных целевых соединений были разработаны конвергентные схемы синтеза в 5-7 стадий исходя из доступных соединений на основе схема синтеза люциферина грибов 3-гидроксигиспидина, ранее разработанной в нашей лаборатории. Все методики были нами апробированы, мы наработали ключевые промежуточные билдинг-блоки. Также на основании анализа установленного ранее в нашей лаборатории механизма биолюминесценции высших грибов мы предложили ряд аналогов люциферина с различным расположением O-содержащих заместителей - вероятных ингибиторов люциферазы. Из всего разнообразия возможных изомерных соединений был определен список из пяти целевых молекул в соответствии с требованиями стабильности и их синтетической доступности. Для всех целевых соединений на основании литературных данных были предложены оптимальные схемы синтеза в 3-10 стадий из коммерчески доступных исходных соединений. Осуществлена апробация предложенных методик, наработаны промежуточные исходные продукты. Один из целевых аналогов был полностью синтезирован в шесть стадий с общим выходом 30%. На будущий год запланированы работы по завершению синтеза всех целевых соединений в количествах, необходимых для проведения дальнейших биологических экспериментов, а также подбор условий их выделения и характеризация современными физико-химическими методами.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящий проект нацелен на оптимизацию люциферин-люциферазной пары биолюминесцентной системы высших грибов. Планируется этого достичь путем использования нескольких стратегий: (а) разработка новых аналогов люциферина с улучшенными спектральными характеристиками, (б) отбор генов люцифераз из светящихся грибов разных видов. (в) подбор оптимальных пар люциферин-люцифераза с улучшенными спектральными характеристиками для разработки биоимиджинговых методов. По итогом работы за второй год по проекту, был завершен синтез ряда функциональных аналогов люциферина грибов по стратегиям, разработанным в течение первого года работы – соединения, содержащие п-аминозамещенные бензольные фрагменты с удлиненной сопряженной системой, а также гетероциклические заместители. Также были исследованы различные подходы к синтезу кумариновых аналогов люциферина, однако ни одна из примененных стратегий не привела к удовлетворительному результату, в том числе, в связи с низкой стабильностью получаемых производных. В связи с этим осуществить синтез ряда кумариновых аналогов люциферина оказалось невозможным. В итоге получены девять новых аналогов люциферина грибов. Все целевые соединения были очищены хроматографическими методами, охарактеризованы методами ЯМР и масс-спектрометрии. Был проведен синтез еще трех аналогов люциферина с различным расположением О-содержащих заместителей – вероятных ингибиторов люциферазы. Структуры целевых соединений были подтверждены методами ЖХ-МС и ЯМР-спектроскопии. Помимо заявленных ранее структур, дополнительно были предложены и получены три новых 4-пиридоновых аналога люциферина, соединения также охарактеризованы методами ЯМР и масс-спектрометрии. В итоге в целом за два года работы по проекту был разработан и осуществлен синтез 9 функциональных аналогов люциферина грибов и 7 аналогов – вероятных ингибиторов люциферазы грибов. Другой задачей проекта было тестирование люминесцентной активности и ингибирующих свойств синтезированных соединений in vitro. Показано, что семь из девяти полученных функциональных аналогов проявляют биолюминесцентную активность с люциферазой, и все ингибиторы проявляют ингибирующую активность в реакции окисления 3-гидроксигиспидина люциферазой N. nambi. Был проведен отбор генов люцифераз из девяти видов светящихся грибов (помимо N. nambi), затем были созданы генетические конструкции c использованием отобранных генов и осуществлена их гетерологичная экспрессия в клетках дрожжей P. pastoris. Таким образом, были получены 10 различных клонов, каждый из которых экспрессирует люциферазы отобранных видов грибов. В ходе работ по проекту была проведена обработка клеток, экспрессирующих люциферазы из светящихся грибов, синтезированными аналогами люциферина, методом дроп-тест. Показано, что два функциональных аналога люциферина не проявляют биолюминесцентную активность с дрожжевыми клетками, однако три аналога демонстрируют повышенную активность с альтернативными люциферазами по сравнению с контрольной системой люциферин грибов (3-гидроксигиспидин) – люцифераза N. nambi. По результатам дроп-тестов определены три наиболее эффективные пары аналог люциферина – люцифераза. Измерена относительная биолюминесцентная активность для функциональных аналогов люциферина в реакции с люциферазой N.nambi. Показано, что пять соединений проявляют большую активность, чем контрольный природный люциферин. При этом один синтетический аналог проявляет активность, на порядок превышающую активность природного люциферина. Определены значения констант Михаэлиса для изучаемых реакций, а также измерены спектры люминесценции для пары люцифераза N.nambi – аналог люциферина. Дополнительно были изучены ингибиторные свойства для шести синтезированных аналогов-вероятных ингибиторов люциферазы N.nambi. Все соединения проявляют ингибирование реакции 3-гидроксигиспидин – люцифераза N.nambi. Для трех соединений измерены константы ингибирования. Еще одной задачей проекта было изучение субстратной толерантности ферментов биосинтеза люциферина грибов по отношению к девяти природным и синтетическим аналогам кофейной кислоты in vivo. Не для всех изучаемых исследуемых субстратов наблюдалось свечение, однако для четырех аналогов фиксировалась биолюминесценция клеточной культуры при добавлении субстрата, что указывает на широкую субстратную специфичность изучаемых ферментов каскада люминесценции грибов. Таким образом, все запланированные на второй год результаты были достигнуты. Полученные данные будут использованы в дальнейшей работе по проекту с целью поиска оптимальной пары с точки зрения биоимиджинга пары аналог люциферина – люцифераза грибов.