КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-73-10032
НазваниеЛекарственные носители с обратной рН-чувствительностью и способностью к быстрому высвобождению как альтернативный путь доставки лекарств
РуководительЕрмаков Алексей Вадимович, Кандидат физико-математических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2025 |
Конкурс№71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-406 - Химическая термодинамика. Физическая химия поверхности и межфазных границ. Адсорбция
Ключевые словаЛекарственные носители, pH-чувствительность, доставка лекарств, противораковые лекарства, низкомолекулярные соединения, контролируемое высвобождение веществ, внутривенная доставка in vivo, иммобилизация низкомолекулярных веществ, частицы силиката, субмикронные частицы
Код ГРНТИ76.09.00, 31.15.37
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Одним из распространенных методов повышения эффективности химиотерапии является инкапсулирование химических агентов в рН чувствительные носители, поскольку низкомолекулярные химиотерапевтические соединения легко проникают через стенки капилляров не только в опухоль, но и в здоровую ткань, вызывая токсикологический стресс.
Данный подход обусловлен известным фактом, что рН внутри опухоли несколько ниже физиологического, таким образом высвобождение вещества в ответ на понижение рН внешней среды является очевидным решением для повышения эффективности химиотерапии и снижения системной токсичности применяемого агента. Однако, на практике подход системной доставки инкапсулированных препаратов показывает достаточно скромные результаты. Одной из причин этого является их значительное накопление в критических органах, включающих печень и селезёнку, которые образуют мононуклеарную фагоцитарную систему. При этом внутриклеточное пространство макрофагов также характеризуются низкими значениями рН, что приводит к быстрому высвобождению химиотерапевтических соединений в критических органах.
Быстрая секвестрация носителей в фагоцитарную систему существенно снижает время нахождения частиц в кровотоке, в некоторых случаях до 1 минуты, и, как результат, кардинально снижает эффективность доставки полезного терапевтического агента в целевую опухоль, как было ранее показано членами научного коллектива [Applied Materials Today 2021; 25: 101199]. Ряд подходов, включая поверхностную модификацию носителей, оптимизацию их размера и формы, позволили снизить влияние секвестрации носителей в мононуклеарную фагоцитарную систему и повысить время циркуляции носителей в крови. Однако, по-прежнему токсикологический стресс в результате высвобождения веществ при захвате в критических органах является доминирующим процессом. Более того, проникновение носителей в опухолевую ткань после экстравазации из капилляров является крайне медленным процессом в сравнении с диффузией низкомолекулярных химиотерапевтических препаратов, что значительно снижает эффективность терапии посредством систем доставки лекарств.
Для преодоления обозначенных проблем в данном проекте предлагается кардинально новый подход к доставке лекарств и дизайну лекарственных носителей, основанный на двух ключевых принципах. Первым принципом является применение нано- и субмикронных носителей с возможностью прецизионно контролируемого быстрого (от 10 минут до 3 часов) высвобождения инкапсулированного низкомолекулярного терапевтического агента в совокупности с высокой адгезией к эндотелию сосудов и капилляров метастазирующих опухолей, которые, как правило, характеризуются невысокой скоростью потока крови. Локальное высвобождение терапевтического соединения в интракапиллярное пространство позволит таким образом создать высокий градиент его концентрации с последующей диффузией в паренхиму опухоли. Вторым принципом является высвобождение инкапсулированного вещества при физиологических значениях рН (7,35 – 7,45) и устойчивое хранение инкапсулированного вещества при кислотных значениях рН (ниже 6), то есть зависимость обратная к традиционно применяемой при системной доставки веществ в опухоль. Предполагается, что данный принцип позволит повысить устойчивость инкапсулированного химиотерапевтического соединения к иммунному ответу при системной доставке и снизить токсикологический стресс на печень и селезенку.
В рамках данного проекта планируется решить поставленные задачи путем применения модифицированных нано- и субмикронных частиц силики в качестве носителей для доставки терапевтических агентов в опухоль in vivo.
Научная новизна проекта заключается в применении обозначенных принципов, предлагающих концепцию быстрого прецизионно контролируемого высвобождения терапевтических агентов из носителей с обратной рН-чувствительностью и высокой адгезий к эндотелиальным клеткам.
Для решения поставленных в проекте целей и задач был собрано сбалансированный научный коллектив, включающий специалистов в области физики и химии, биомедицинской инженерии, биологии и медицины. Междисплинарный характер планируемой работы повышает сложность исследования, однако высокая квалификация и широкая квалификация руководителя и членов научного коллектива отвечает данному уровню.
Ожидаемые результаты
В рамках предлагаемого проекта планируется получение двух ключевых результатов. Первым результатом станет проведение доставки химиотерапевтических низкомолекулярных соединений альтернативным способом – посредством лекарственных носителей с быстрым высвобождением инкапсулированного терапевтического соединения в сосудах, окружающих опухоль с последующей диффузией соединения в паренхиму опухоли. Такой способ доставки принципиально отличается от существующих аналогов и ожидается, что он позволит использовать преимущества системной доставки посредством носителей с преимуществами традиционного введения терапевтических агентов в свободной форме и таким образом обеспечить эффективную диффузию доставляемого носителя в опухоль при сниженных побочных эффектах. Вторым ключевым результатом будет служить снижение токсикологических эффектов, оказываемых лекарственными носителями, нагруженными низкомолекулярными химиотерапевтическими агентами, на печень посредством обратной рН-чувствительности к окружающей среде, то есть устойчивое удержание инкапсулированных агентов при рН ниже 6 и высвобождение при физиологических значения рН, что позволит замедлить высвобождения лекарственных средств при секвестрации носителей в мононуклеарную фагоцитарную систему и, соответственно, снизить токсикологическией стресс на печень.
Для этой цели будет получен спектр результатов в ходе решение подзадач. В первую очередь будут синтезированы и оптимизированы мезопористые субмикронные частицы силикатов: подобран размер, форма (от сферической до пластинчатой), химические свойства поверхности. Будут разработаны и оптимизированы методики инкапсулирования низкомолекулярных терапевтических соединений в полученные мезопористые частицы, детально исследованы структура и физико-химические свойства полученных систем. Будут получены профили высвобождения низкомолекулярных терапевтических соединений из полученных частиц с выходом вещества в течение трех часов в модельных физиологических условиях. Будут разработаны методики модификации поверхности мезопористых частиц силикатов функциональными полимерами и гелями. Ожидается, что модификация поверхности мезопористых частиц рН-чувствительными полимерами и гелями позволит получить рН-зависимые профили высвобождения низкомолекулярных веществ. Будут получены профили высвобождения из рН-чувствительных структур ядро-оболочка на основе мезопористых субмикронных частиц силикатов интернализованных макрофагами, кислая среда эндосом и лизосом которых позволит зафиксировать снижение концентрации высвобожденного вещества. Наряду с этим будет проведено исчерпывающее тестирование полученных частиц в условиях in vitro, что включает получение информации об адгезии частиц к клеточным сфероидам эндотелиальных клеток, профили диффузии частиц и высвобожденных низкомолекулярных веществ в сфероиды раковых клеток, цитотоксичность полученных систем. Важным результатом будет являться визуализация высвобождения инкапсулированного терапевтического соединения в условиях in vitro методом микроскопии FLIM для детализации кинетики процесса.
Переходя к экспериментам in vivo будет получен большой объем результатов для подтверждения безопасности применения полученной системы. Исследование сосудистых и тканевых реакций, реологии крови и микроциркуляции наряду с выявлением иммунного ответа организма, а также оценка токсических изменений органов позволит оценить последствия введения разрабатываемых частиц, нагруженных химиотерапевтическими соединениями и провести оптимизацию системы. Предполагается, что применение лекарственных носителей с обратной рН-чувствительностью позволит Следующий блок результатов исследований в условиях in vivo будет направлен на выявление поведения разработанной системы в организме, а именно установление фармакокинетики введённого терапевтического агента посредством лекарственных носителей, качественная и количественная оценка накопления в критических органах методами спектрофлуометрии и масс спектрометрии, а также процессов биодеградации лекарственных носителей при секвестрации носителей в мононуклеарную фагоцитарную систему. Важным результатом будет визуализация методом интравитальной микроскопии процесса накопления полученных носителей в сосудах, окружающих модель опухоли в животных, и процесса высвобождения инкапсулированного терапевтического соединения с последующей диффузией в опухоль. Будет проведен анализ профиля диффузии инкапсулированной формы и высвобожденного из носителей низкомолекулярного терапевтического агента в опухолевом узле. На последнем этапе будет оценен терапевтический эффект от применения лекарственных носителей, загруженных низкомолекулярными терапевтическими соединениями и сравнение с введением свободной формы соединения позволит оценить эффективность разрабатываемой системы.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Первый год выполнения проекта был посвящен в больше степени химическим аспектам разработки лекарственных носителей с повышенной долей высвобожденного вещества при пониженной кислотности (ниже 5), что соответствует рН в фагосомах макрофагов и лизосомах клеток, и высокой долей высвобожденного вещества при физиологическом уровне рН (7.4), соответствующим крови человека. Разработка структуры частицы была проведена наравне с базовой характеризацией в условиях in vitro, включая цитотоксичность с использованием опухолевых клеток и мышиных макрофагов, а также глубину проникновения в модельные ткани, а именно клеточные сфероиды.
В ходе выполнения первого года проекта был проведен подробный литературный обзор существующих рН-чувствительных систем доставки лекарств и существующих трудностей. На основе литературных данных сделан вывод о превалирующей роли дзета-потенциала частиц для проведения загрузки лекарственных носителей препаратами, относительно геометрических параметров применяемых носителей, таких как размер пор и внутренний объем. Кроме того, сделан вывод о повышенной эффективности лекарственных носителей, способных к быстрому высвобождению инкапсулированного препарата независимо от цели доставки, а также о необходимости использования носителей с большой загрузочной способностью, что, вероятно, продиктовано необходимость достижения в опухоли и опухолевых клетках определенной терапевтической дозы препарата.
На основе этих данных в ходе работы отдано предпочтение использованию субмикронных сферических частиц кремнезёма класса AMS-6. Альтернативные классы частиц кремнезёма были расценены как несоответствующие требованиям из-за низкой загрузочной способности и/или длительного высвобождения (вплоть до 72 ч) загруженных соединений. Соответствующие частицы AMS-6 были синтезированы с характерным размером 550 ± 48 нм и размером пор 4.5 ± 0.3 нм, а также дзета-потенциалом в 15 мВ, что позволило осуществить эффективную загрузку относительно крупных молекул (конъюгат красителя с бычьим сывороточным альбумином BSA-TRITC). Полученные данные по загрузке и дальнейшие данные по высвобождению были поставлены в сравнении с частицами карбоната кальция в связи с их собственной рН-чувствительностью без дополнительных модификаций.
Применено и оптимизировано две методики загрузки частиц кремнезёма для загрузки как высокомолекулярного соединения BSA-TRITC, так и низкомолекулярных фотодинамических препаратов (порфиразин, фталоцианин цинка) на основе подходов заморозки и выпаривания жидкой фазы. В то время, как заморозка показала низкую эффективность загрузки в отношении частиц кремнезёма AMS-6 (в отличии от частиц карбоната кальция, которые показывают высокую загрузочную способность, опосредованную данным методом), при использовании методов выпаривания как конъюгат, так и низкомолекулярные препараты были загружены с высокой эффективностью. Загрузочная способность частиц кремнезёма AMS-6 при этом варьировалась в диапазоне 28-34%.
Исследование кинетики высвобождения загруженных веществ из частиц данного класса в модельных условиях (0.9% хлорид натрия при 37°С) показало, что профили высвобождения обладают линейной зависимостью в течение первых трех часов приводя к высвобождению более чем 60% загруженного вещества с последующим выходом на плато.
Далее, для придания системе рН-зависимого профиля высвобождения инкапсулированного вещества была разработана методика формирования оболочек из альгината. Таким образом, разработан подход к формированию структур ядро-оболочка на основе гидрогелевых оболочек из альгината, демонстрирующих рН-зависимые свойства, на поверхности мезопористых частиц карбоната кальция и кремнезёма класса AMS-6.
В ходе работы была исследована загрузочная способность полученных частиц, а также исследована кинетика высвобождения модельного вещества, конъюгата TRITC-BSA. Полученные профили высвобождения из ядер различной природы показали рН-зависимый режим поведения с повышенной долей высвобожденного вещества в единицу времени при физиологическом уровне рН (7.4) и пониженным высвобождением при пониженном рН = 4.5, соответствующим минимальным значениям рН в лизосомах клеток и фагосомах макрофагов. При этом обладая достаточно высоким уровнем высвобождения в условиях физиологического рН (7.4) в 30% от инкапсулированного в течение часа.
Результаты исследования цитотоксичности полученных частиц показали, что, хотя загруженные фотодинамическим препаратом фталоцианин цинка частицы кремнезёма обладают повышенной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток MCF7 и мышиных макрофагов (различие цитотоксичности в диапазоне 5-10%), свободная форма фталоцианина цинка обладает повышенной цитотоксичностью в отношении исследованных опухолевых клеток и мышиных макрофагов.
В тоже время исследование глубины проникновения на клеточных сфероидах показали, что как оригинальные частицы кремнезёма AMS-6, так и частицы кремнезёма, покрытые альгинатными оболочками, показывают ожидаемо низкое проникновение в клеточный сфероид и составляет 2-3 клеточных слоя с постепенной диффузией инкапсулированного агента из частиц в глубь сфероида.
Исследование действия макрофагов на скорость высвобождения инкапсулированного в частицы кремнезёма красителя cy7 показало, что значимой разницы в доле высвобожденного вещества в единицу времени в зависимости от структуры частиц (частицы кремнезёма класса AMS-6 с покрытием из альгината и без него) не наблюдается, что, по всей вероятности, обусловлено высокой активностью ферментов внутри фагосом в отношении альгинатного покрытия, что не позволяет выявить рН-зависимый профиль высвобождения при поглощении частиц макрофагами.
Этот результат показал необходимость использования рН-чувствительных материалов оболочки, обладающих повышенной устойчивостью к действию ферментов фагосом для обеспечения пролонгированного эффекта с рН зависимым профилем высвобождения в условиях in vitro. На основе литературного обзора был сделан вывод о применимости для этих целей гидроксипропилметилцеллюлозы.
На основе данного типа целлюлозы были сформированы оболочки на поверхности частиц кремнезёма класса AMS-6 и карбоната кальция. Оба типа частиц показали устойчивый рН-зависимый профиль высвобождения инкапсулированного конъюгата BSA-TRITC. Дальнейшее исследование гидроксипропилметилцеллюлозы как самостоятельной оболочки, так и композитных мультислойных оболчочек с включением альгината открывает перспективы для повышения устойчивости частиц к действию ферментов макрофагов.
Публикации
1. Кузнецов А.О., Власичева Ю.Н. , Ленгерт Е.В., Ермаков А.В. ФОРМИРОВАНИЕ СТРУКТУР ЯДРО-ОБОЛОЧКА С ВОЗМОЖНОСТЬЮ pН-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ Коллоидный журнал, - (год публикации - 2023)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведена работа по разработке и синтезу мультикомпонентных лекарственных носителей со структурой «ядро-оболочка» с рН-зависимым профилем высвобождения веществ, обратным к традиционно используемой в системной доставке лекарств. Полученные лекарственные носители тщательно исследованы с целью оценки их применимости в качестве средства доставки лекарств, включая физико-химические свойства, морфологию, загрузочную способность, профили высвобождения в модельных средах, коллоидную стабильность и другие. Конечная конфигурация частиц включала несколько слоев альгината и целлюлозы с использованием мезопористых частиц кремнезёма в качестве ядра
На следующем этапе работы было проведено исследование полученной системы в условиях in vitro с обратной связью для коррекции состава и структуры частиц. С помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии исследовано взаимодействие полученных носителей с иммунными клетками и исследовано высвобождение инкапсулированных в них модельных флуоресцентных соединений при интернализации макрофагами. Далее оценена безопасность применения таких носителей при системной доставке путем исследования изменения реологии крови при введении частиц и агрегации тромбоцитов.
Проведен комплекс экспериментов на установление особенностей поведения полученных носителей в условиях in vivo, включая изменения в биохимии крови, а также биораспределение инкапсулированного соединения. Установлено, что применение рН чувствительных оболочек обеспечивает устойчивость носителей к действию иммунной системы, что согласно ранее проведенному исследованию должно способствовать снижению токсического эффекта на организм.
Публикации
1. Иванов А.Н., Кузнецов А.О., Лойко Д.Д., Власичева Ю.Н., Ленгерт Е.В., Ермаков А.В. Изменения функциональной активности тромбоцитов под влиянием субмикронных частиц на основе мезопористого кремнезема и рН-чувствительных полимеров Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2024)
2. Ленгерт Е.В., Власичева Ю.Н., Кузнецов А.О., Гуслякова О.И., Ермаков А.В. Влияние состава оболочки на эффективность интернализации рН-чувствительных лекарственных носителей на основе мезопористых частиц Перспективные материалы, - (год публикации - 2024)
3. Верховский Р.А., Иванов А.Н., Ленгерт Е.В., Тулякова К.А., Шилягина Н.Ю., Ермаков А.В. Current Principles, Challenges, and New Metrics in pH-Responsive Drug Delivery Systems for Systemic Cancer Therapy Pharmaceutics, Т. 15, № 5, с. 1566 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15051566
4. Ермаков А.В., Верховский Р.А., Иванов А.Н., Ленгерт Е.В. Современные подходы к дизайну лекарственных носителей для рН-чувствительных систем доставки: основные принципы и проблемы Бутлеровские сообщения, том 77, №2, С.1-22 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.37952/ROI-jbc-01/24-77-2-1