КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-73-10205

НазваниеРазработка ультрачувствительной аналитической системы для одновременного экспрессного определения нескольких кардиомаркеров в крови человека

РуководительОрлов Алексей Владимирович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (41).

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые словаАналитическая химия, биосенсорика, детекция кардиомаркеров, иммуноанализ, экспресс тест-системы, регистрация магнитных наночастиц, анализ крови у кровати пациента, диагностика инфаркта миокарда, диагностика сердечной недостаточности, диагностика риска острого коронарного синдрома

Код ГРНТИ31.19.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В настоящее время острый инфаркт миокарда по-прежнему является одной из главных причин смертности во всем мире. Снижение летальности, связанной с этим заболеванием, путем внедрения современных методов ранней диагностики и лечения остается одной из приоритетных задач здравоохранения. Как было отмечено в заявке Проекта 2019, практически все самые современные диагностические приборы и расходные материалы для детекции кардиомаркеров представлены ведущими производителями из США и Западной Европы, и эта ситуация за прошедшие три года не претерпела существенных изменений. Уже в заявке Проекта 2019 было высказано опасение, что использование зарубежных тест-систем в такой чувствительной области, как диагностика сердечно-сосудистых заболеваний, несет в себе дополнительные риски. В настоящее время значимость развития отечественных разработок в этой сфере не только не потеряла актуальности, но и приобрела характер критической важности. Проекты 2022 и 2019 объединены общей целью: оба Проекта посвящены созданию аналитических систем для ультрачувствительного определения кардиомаркеров. В Проекте 2022 идеи и подходы, разработанные в рамках Проекта 2019, получат существенное развитие. Будут решены новые задачи в каждом из ключевых направлений разработки аналитических систем, а именно: - будут использованы новые типы сенсорных поверхностей, в том числе однослойные графеновые плёнки; будут применены новые методы их функционализации биораспознающими молекулами; - будут продемонстрированы возможности применения новых трехмерных форматов анализа, перспективных для определения кардиомаркеров непосредственно в цельной крови и основанных на использовании волоконных ориентированных макропористых структур; - будут применены новые перспективные классы биораспознающих молекул, в том числе кардиомаркер-специфичные аптамерные последовательности; - будут разработаны и испытаны новые типы магнитных нанометок, в том числе магнитные наноцепи, обеспечивающие новые возможности для принципиального роста чувствительности и скорости магнитного анализа; - будут протестированы новые методы детектирования аналитического сигнала, в том числе основанные на синхронном детектировании сигналов, модулированных за счет пространственной переориентации анизотропных магнитных наноматериалов несферической формы. Большая часть поставленных для Проекта 2022 задач представляет собой первое в мировой научной практике решение научных проблем, актуальных в рамках общей для Проектов 2019 и 2022 цели. При этом все задачи, которые предполагается решить в рамках Проекта 2022, с одной стороны, являются новыми, а с другой стороны – неразрывно связаны с научным заделом, достигнутым в рамках реализации Проекта 2019 в области создания ультрачувствительных систем для определения кардиомаркеров. В качестве основных изучаемых кардиомаркеров в Проекте 2022 будут использованы современные специфичные белковые кардиомаркеры, требующие создания высокочувсвительных аналитических систем, а именно: N-терминальный промозговой натрийуретический пептид (NT-proBNP); сердечный тропонин I (сТнI); сердечная форма белка, связывающего жирные кислоты (сБСЖК). По мнению авторов Проекта, высокая актуальность проблемы в сочетании с уникальными подходами к разработке, обеспечивающей аналитические характеристики, не имеющие мировых аналогов, позволяет рассчитывать на публикацию результатов Проекта в высокорейтинговых научных журналах.

Ожидаемые результаты
Основные задачи, поставленные для Проекта 2022, представляют собой первое в мировой научной практике решение научных проблем, актуальных в рамках общей для Проектов 2019 и 2022 цели создания аналитических систем для ультрачувствительного определения кардиомаркеров. Исходя из задач Проекта 2022 ожидается достижение следующих результатов: 1. Будут разработаны биофункционализированные магнитные анизотропные наноматериалы (в частности наноцепи) и их применения для количественного определения изучаемых кардиомаркеров с целью повышения чувствительности, специфичности и скорости анализа. Будут разработаны научные основы получения и эффективного использования магнитных нанометок нового типа, которые будут применяться в сочетании с разработанными в рамках Проекта-2019 методами и подходами, в первую очередь – со сверхчувствительным магнитным детектором и количественным ультрачувствительным магнитным иммунохроматографическим анализом (в том числе многопараметрическим). 2. Будет разработан новый метод экспрессной количественной регистрации кардиомаркеров непосредственно в цельной крови, основанного на трёхмерном формате иммунохроматографического анализа в сочетании с электронной регистрацией магнитных наномаркеров во всём объёме пористых структур. Для иммунохроматографического детектирования кардиомаркеров будут использованы не плоские тест-полоски, а впервые – трёхмерные цилиндрические волоконные структуры, содержащие все заранее нанесённые компоненты для проведения анализа: зону конъюгата, содержащую магнитные биоконъюгаты; тестовую зону, содержащую иммобилизованные моноклональные антитела; зону впитывания, обеспечивающую миграцию анализируемого раствора под действием капиллярных сил. Планируется, что такой подход не только будет обладать всеми преимуществами стандартной иммунохроматографии и позволит реализовать точный количественный анализ в широком диапазоне концентраций, но и устранит одно из наиболее существенных ограничений стандартных экспресс-тестов на основе тонкослойной иммунохроматографии, а именно – принципиальную сложность создания точных воспроизводимых количественных анализовдля тестирования цельной крови или сыворотки крови человека. 3. Будет разработан новый прямой оптический безмаркерный метод регистрации кардиомаркеров с использованием стеклянного сенсорного чипа с плёнкой из биофункционализированного графена. Планируется, что для этой цели будет использоваться фотоиндуцированная функционализация поверхности графена с помощью фенилазид-модифицированных последовательностей. 4. Будут созданы методы определения кардиомаркеров с помощью применения новых перспективных классов биораспознающих молекул, в частности кардиомаркер-специфичных аптамерных последовательностей. Будут использованы одноцепочечные ДНК-аптамеры в качестве биораспознающих молекул, специфичных к анализируемым кардиомаркерам, в сочетании с разрабатываемыми в рамках Проекта подходами. Создание аптасенсоров является ещё одной перспективной (но не рассмотренной в рамках Проекта 2019) возможностью разработки надёжных, воспроизводимых, масштабируемых и при этом чувствительных и специфичных методов детекции биомолекул. 5. Будут разработаны научные основы создания новых методов детектирования аналитического сигнала в рамках решения вышеописанных задач Проекта 2022, обладающих, по крайней мере, на порядок более низким пределом детектирования по сравнению с использованными в Проекте 2019 высокочувствительными подходами. Таким образом, разработанные в рамках Проекта 2022 методы в сочетании с подходами, развитыми в Проекте 2019, могут в перспективе использоваться для точной количественной диагностики острого инфаркта миокарда по анализу крови на содержание кардиомаркеров в условиях, когда состояние больного не позволяет ждать результатов лабораторных исследований. При этом методы будут достаточно простыми для использования средним медицинским персоналом непосредственно у кровати пациента или в машине скорой помощи. Кроме того, разрабатываемые в Проекте методы могут быть в дальнейшем использованы для решения такой важной задачи, как диагностика заболеваний в фельдшерских пунктах малонаселенных районов Российской Федерации, где из-за недостаточной оснащенности больниц и нехватки квалифицированного персонала врачи зачастую вынуждены руководствоваться только своим опытом, а порой и интуицией. Отметим, что в настоящем Проекте 2022 сохранились все основные исполнители Проекта 2019, а их опыт (полученный в том числе в ходе реализации Проекта 2019) позволяет рассчитывать, что результаты по Проекту 2022 будут на таком же высоком уровне с возможностью публикаций и в более рейтинговых журналах.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Все запланированные в отчетном периоде работы выполнены и научные результаты достигнуты в полном объеме. В частности, подготовлены 2 отчётные публикации (одна статья, опубликована в журнале Q1; вторая принята к публикации в томе российского журнала Q2, выходящего в печать в июле-августе 2023 г). Таким образом, годовой публикационный план выполнен с опережением по сравнению с запланированным темпом. С учётом перевыполнения публикационного плана в рамках уже завершившегося Проекта-2019, продолжением которого является настоящий Проект, успешное выполнение итоговых публикационных показателей Проекта-2022 исполнителям представляется весьма вероятным. Были получены следующие конкретные результаты: Разработаны и охарактеризованы биофункционализированные анизотропные магнитные наноструктуры (АМН); продемонстрировано их применение для количественного определения концентраций изучаемых кардиомаркеров (cTnI, NT-proBNP, сБСЖК); показана возможность повышения с их помощью чувствительности, специфичности и скорости анализа. Продемонстрированы возможности использования разработанных АМН в сочетании с сверхчувствительным магнитным детектором и концепцией количественного магнитного иммунохроматографического анализа (в том числе, многопараметрического). Разработан метод скоростного сверхчувствительного определения кардиомаркеров на основе графеновых полевых транзисторов с жидкостным затвором и одностадийной функционализации поверхности графена азид-модифицированными ДНК-аптамерами. Эффективность данного метода была продемонстрирована на примере регистрации кардиомаркера NT-proBNP. Для этого использован 3′-азид-модифицированная последовательность ДНК-аптамера, специфичная к NT-proBNP. Достигнуты не имеющие мировых аналогов аналитические характеристики. Отчётные публикации за первый год выполнения Проекта: 1. А.В. Орлов, Ю.А. Малкеров, А.М. Скирда, Д.О. Новичихин, С.Л. Знойко, В.А. Брагина, П.И. Никитин. (2022). Cверхчувствительная регистрация полифункциональных магнитных наноматериалов для экспрессного определения молекулярных маркеров заболеваний. Доклады Российской академии наук. Физика, технические науки. Принята к публикации в 2023 году, Том 511 (июль-август). Q2 2. Nekrasov N., Kudriavtseva A., Orlov A.V., Gadjanski I., Nikitin P.I., Bobrinetskiy I., Knezevic N.Ž. (2022). One-Step Photochemical Immobilization of Aptamer on Graphene for Label-Free Detection of NT-proBNP. Biosensors, 12(12), 1071. Q1

 

Публикации

1. Некрасов Н., Кудрявцева А., Гаджанский И., Никитин П.И., Бобринецкий И., Кнежевич Н.Ж. One-Step Photochemical Immobilization of Aptamer on Graphene for Label-Free Detection of NT-proBNP Biosensors, V. 12, P. 1071 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/bios12121071

2. Орлов А.В., Малкеров Ю.А., Скирда А.М., Новичихин Д.О., Знойко С.Л., Брагина В.А., Никитин П.И. Сверхчувствительная регистрация полифункциональных магнитных наноматериалов для экспрессного определения молекулярных маркеров заболеваний Доклады Российской академии наук. Физика, технические науки, Т. 511 (год публикации - 2023)

3. Орлов А.В. Real-time Detection of Molecular Markers in Complex Biological Matrices Proceedings of 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), IEEE Xplore, 21955726 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1109/ICLO54117.2022.9839990

4. Орлов А.В., Мизиев С.В., Гутенева Н.В. Controlled surface topology for tunable kinetics of biomolecular interactions monitored with a label-free optical biosensor for detection of cardiac markers Proceedings of 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), IEEE Xplore, 21955381 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1109/ICLO54117.2022.9840108

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе второго года выполнения проекта были успешно выполнены все запланированные работы и достигнуты все запланированные результаты в области разработки сверхчувствительных биосенсорных систем для определения кардиомаркеров. Разработан прямой оптический безмаркерный метод регистрации кардиомаркеров, основанный на использовании стеклянного сенсорного чипа с биофункционализированной графеновой плёнкой. Разработан сверхчувствительный безмаркерный аптасенсор для определения кардиомаркера NT-proBNP на основе полевого транзистора с жидкостным затвором и монослоя восстановленного оксида графена, на котором был иммобилизован аптамер, специфичный к NT-proBNP. В оптимальных условиях была продемонстрирована высокая чувствительность, а также показана возможность определения NT-proBNP в искусственной слюне. Продемонстрирована возможность использования разработанных аптасенсоров для анализа образцов слюны. Для этого были подготовлены образцы на основе искусственной слюны, имитирующей химический состав и вязкость настоящей слюны, с различными концентрациями добавленного NT-proBNP. При проведении анализа не применялась какая-либо дополнительная пробоподготовка образцов (таким образом, разработанный сенсор, вероятно, могут быть в перспективе использован в реальных условиях для анализа образцов слюны). Разработанный сенсор может быть использован для анализа слюны пациентов с различными стадиями сердечной недостаточности, а также для диагностико-прогностического скрининга. При использовании образцов искусственной слюны результаты коррелировали с данными калибровки, полученной в буферном растворе, что указывает на отсутствие существенного влияния матрицы слюны на работоспособность разработанного сенсора. Разработаны и сравнены между собой аптасенсоры на основе CVD-графена и на основе восстановленного оксида графена с точки зрения аналитических характеристик сенсоров при обнаружении NT-proBNP. С помощью данных биосенсоров был продемонстрирован широкий динамический диапазон опеределения кардиомаркера NT-proBNP. Созданные биосенсоры обладают относительно низкой стоимостью, что в сочетании с масштабируемостью используемых для из создания технологий, может быть перспективно для разработки различных графеновых биосенсоров для быстрого, точного и высокочувствительного обнаружения различных биохимических маркеров, в первую очередь – кардиомаркеров. Проведены исследования, посвященные теоретическому анализу перспективных диагностических маркеров и потенциальных терапевтических мишеней при сердечно-сосудистых заболеваниях. Применён метод мСКИ, который продемонстрировал высокую эффективность при количественном определении изменений толщины биослоя на графеновой поверхности сенсорного чипа в режиме реального времени. Это позволило точно регистрировать биохимические реакции, подтверждая возможность использования однослойного графена в качестве сенсорного материала, достигнута высокая чувствительность к связыванию трёх различных кардиомаркеров (сБСЖК, сТнI и NT-proBNP). В течение года опубликованы 3 отчётные публикации в журналах Q1.

 

Публикации

1. Кудрявцева А., Jarić S., Некрасов Н., Орлов А.В., ГGadjanski I., Бобринецкий И., Никитин П.И., Knežević N. Comparative Study of Field-Effect Transistors Based on Graphene Oxide and CVD Graphene in Highly Sensitive NT-proBNP Aptasensors Biosensors, 14(5), 215 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.3390/bios14050215

2. Ярич С., Кудрявцева А., Некрасов Н., Орлов А.В., Комаров И.А., Барсуков Л.А., Гаджанский И., Никитин П.И., Бобринецкий И. Femtomolar detection of the heart failure biomarker NT-proBNP in artificial saliva using an immersible liquid-gated aptasensor with reduced graphene oxide Microchemical Journal, V. 196., P. 109611 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1016/j.microc.2023.109611

3. Васильева А.В., Гладкова М.Г., Ашниев Г.А., Осинцева Е.Д., Орлов А.В., Кравчук Е.В., Болдырева А.В., Буренин А.Г., Никитин П.И., Орлова Н.Н. Super-Enhancers and Their Parts: From Prediction Efforts to Pathognomonic Status International Journal of Molecular Sciences, 25, 6, 3103 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.3390/ijms25063103

Возможность практического использования результатов
Разработанные в рамках проекта технологии и биосенсоры, включая быстрые магнитные иммунохроматографические тест-системы, безмаркерные аптасенсоры и погружные графеновые полевые транзисторы, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет проводить диагностику сердечной недостаточности на самых ранних стадиях, в том числе непосредственно на месте оказания помощи. Это, в свою очередь, может существенно сократить расходы на лечение за счет предотвращения развития тяжелых состояний и уменьшения смертности. Возможность проведения тестов в режиме реального времени без необходимости специализированных лабораторий делает эти технологии перспективными для использования в условиях ограниченного доступа к медицинской инфраструктуре, например, в отдаленных и сельских районах Российской Федерации.