КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 22-74-00024

НазваниеИсследование и оптимизация мембрано-моделирующих систем для структурно-функциональных исследований рецепторов, сопряженных с G-белком

РуководительЛугинина Александра Павловна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2024

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаРецепторы, сопряженные с G-белком, мембрано-подобные системы, лиганд-белковые взаимодействия, структурная биология, мицеллы детергентов, нанодиски

Код ГРНТИ34.17.27

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), - суперсемейство трансмембранных белков, состоящее у человека из более 800 представителей, они участвуют в большинстве физиологических процессов. Более трети современных лекарственных средств направлены на эту группу белков, а в связи с развитием биомедицины в настоящее время, в частности, недавним прорывом в структурных исследованиях GPCR, данное суперсемейство является актуальной мишенью для разрабатываемых кандидатов в лекарства. Однако рецепторы, сопряженные с G-белком, остаются крайне сложными объектами исследования, ввиду их низких природного уровня экспрессии и стабильности, высокой конформационной подвижности и необходимости мембрано-миметирующего окружения для осуществления структурно-функциональных исследований, а также для скринирования новых кандидатов в лекарства in vitro. В настоящее время не существует комплексного исследования по оптимизации мембрано-подобных систем применительно к структурно-функциональным исследованиям GPCR. Таким образом, реализация данного проекта позволит решить проблему стабилизации рецепторов в водных растворах. Это позволит более эффективно применять нанодиски при определении пространственной структуры GPCR при помощи криоэлектронной микроскопии, поспособствовует успешной разработке антительных препаратов методом фагового дисплея, а также исследованию лиганд-белковых взаимодействий такими биофизическими методами, как, например, микромасштабный термофорез (MST) или наноразмерная дифференциальная сканирующая флуориметрия (nanoDSF), что послужит серьёзным подспорьем для структурно-функциональных и биомедицинских исследований этой группы белков.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет проведена экспрессия модельного GPCR: аденозинового рецептора второго типа (A2AAR) в клетках насекомых, а также очистка методами солюбилизации в мицеллы детергентов и металл-аффинной хроматографии. Полученный белковый препарат будет анализироваться на чистоту, стабильность и монодисперсность методами электрофореза, анализа кривых плавления и аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ, соответственно, а также количественно спектрометрическим методом. Будет проводиться оптимизация протокола встраивания модельного белка в различные типы нанодисков, такие как классические на основе аполипопротеина А, с вариацией размеров и возможности мечения, циркуляризованные (ковалентно сшитые с помощью сортазы А или за счет интеинов), нативные (липодиски), а также на основе сапозина. Для каждого мембранного каркасного белка будут оптимизироваться протоколы экспрессии и очистки. Качество встраивания, а также полученный белковый препарат будут повторно анализироваться на чистоту, стабильность и монодисперсность методами электрофореза, анализа кривых плавления и аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ, соответственно, а также количественно спектрометрическим методом. Кроме того методом анализа кривых плавления будет оценен стабилизирующий эффект от связывания с лигандами, косвенно подтверждающий функциональность белка. Эффективность мембрано-моделирующих систем будет охарактеризована структурными методами малоуглового рассеяния, негативного контрастирования (negative stain) и крио-электронной микроскопии. Будет проведено измерение констант связывания с лигандами для A2AAR, встроенного в различные мембрано-миметирующие системы, различными биофизическими методами, а также проанализирована возможность использования данных искусственных систем применительно к указанным методам. Успешное выполнение проекта приведёт к созданию востребованного для современной науки и фармакологии инструмента для структурных и функциональных исследований рецепторов, сопряженных с G-белком.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---