КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-00024

НазваниеИсследование и оптимизация мембрано-моделирующих систем для структурно-функциональных исследований рецепторов, сопряженных с G-белком

РуководительЛугинина Александра Павловна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2024

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словаРецепторы, сопряженные с G-белком, мембрано-подобные системы, лиганд-белковые взаимодействия, структурная биология, мицеллы детергентов, нанодиски

Код ГРНТИ34.17.27

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), - суперсемейство трансмембранных белков, состоящее у человека из более 800 представителей, они участвуют в большинстве физиологических процессов. Более трети современных лекарственных средств направлены на эту группу белков, а в связи с развитием биомедицины в настоящее время, в частности, недавним прорывом в структурных исследованиях GPCR, данное суперсемейство является актуальной мишенью для разрабатываемых кандидатов в лекарства. Однако рецепторы, сопряженные с G-белком, остаются крайне сложными объектами исследования, ввиду их низких природного уровня экспрессии и стабильности, высокой конформационной подвижности и необходимости мембрано-миметирующего окружения для осуществления структурно-функциональных исследований, а также для скринирования новых кандидатов в лекарства in vitro. В настоящее время не существует комплексного исследования по оптимизации мембрано-подобных систем применительно к структурно-функциональным исследованиям GPCR. Таким образом, реализация данного проекта позволит решить проблему стабилизации рецепторов в водных растворах. Это позволит более эффективно применять нанодиски при определении пространственной структуры GPCR при помощи криоэлектронной микроскопии, поспособствовует успешной разработке антительных препаратов методом фагового дисплея, а также исследованию лиганд-белковых взаимодействий такими биофизическими методами, как, например, микромасштабный термофорез (MST) или наноразмерная дифференциальная сканирующая флуориметрия (nanoDSF), что послужит серьёзным подспорьем для структурно-функциональных и биомедицинских исследований этой группы белков.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет проведена экспрессия модельного GPCR: аденозинового рецептора второго типа (A2AAR) в клетках насекомых, а также очистка методами солюбилизации в мицеллы детергентов и металл-аффинной хроматографии. Полученный белковый препарат будет анализироваться на чистоту, стабильность и монодисперсность методами электрофореза, анализа кривых плавления и аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ, соответственно, а также количественно спектрометрическим методом. Будет проводиться оптимизация протокола встраивания модельного белка в различные типы нанодисков, такие как классические на основе аполипопротеина А, с вариацией размеров и возможности мечения, циркуляризованные (ковалентно сшитые с помощью сортазы А или за счет интеинов), нативные (липодиски), а также на основе сапозина. Для каждого мембранного каркасного белка будут оптимизироваться протоколы экспрессии и очистки. Качество встраивания, а также полученный белковый препарат будут повторно анализироваться на чистоту, стабильность и монодисперсность методами электрофореза, анализа кривых плавления и аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ, соответственно, а также количественно спектрометрическим методом. Кроме того методом анализа кривых плавления будет оценен стабилизирующий эффект от связывания с лигандами, косвенно подтверждающий функциональность белка. Эффективность мембрано-моделирующих систем будет охарактеризована структурными методами малоуглового рассеяния, негативного контрастирования (negative stain) и крио-электронной микроскопии. Будет проведено измерение констант связывания с лигандами для A2AAR, встроенного в различные мембрано-миметирующие системы, различными биофизическими методами, а также проанализирована возможность использования данных искусственных систем применительно к указанным методам. Успешное выполнение проекта приведёт к созданию востребованного для современной науки и фармакологии инструмента для структурных и функциональных исследований рецепторов, сопряженных с G-белком.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR) - важные фармакологические мишени и одновременно сложные объекты исследования, ввиду их низкой стабильности и амфифильной природы. Поэтому командой исполнителей проекта ведется разработка мембрано-моделирующих систем для стабилизации GPCR в растворе и упрощения их биофизических исследований. За отчетный период методом бактериальной экспрессии в E.coli были наработаны 11 мембранных каркасных белков, которые составляют амфифильный внешний остов для липидных нанодисков, для дальнейшего встраивания GPCR. Были отработаны и оптимизированы протоколы очистки, опробаваны различные хроматографические подходы. Все исследуемые белки успешно наработаны и очищены, выходы с литра для мембранных каркасных белков составили от 4 до 23 миллиграмм. Полученные белковые препараты заморожены и хранятся на -20°C до дальнейшего использования.

Публикации

1. Д. А. ДМИТРИЕВА, Т. В. КОТОВА, Н. А. САФРОНОВА, А. А. САДОВА, Д. Е. ДАШЕВСКИЙ, А. В. МИШИН Protein Design Strategies for the Structural–Functional Studies of G Protein-Coupled Receptors Biochemistry (Moscow), выпуск 88, стр. 192-226, © Pleiades Publishing, Ltd., 2023 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1134/S0006297923140110

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR) - важные фармакологические мишени и одновременно сложные объекты исследования, ввиду их низкой стабильности и амфифильной природы. Поэтому командой исполнителей проекта проводился поиск новых для данных объектов мембрано-моделирующих систем для стабилизации GPCR в растворе и упрощения их биофизических исследований. За второй год выполнения проекта методом бакуловирусной экспрессии были получены контрольные GPCR, которые затем были очищены путём солюбилизации в мицеллы детергента и показали уровень стабильности, чистоты и монодисперсности, достаточный для дальнейшего встраивания в нанодиски. Был проведён анализ различных типов нанодисков на их стабилизирующие качества, а также пригодность для таких методов исследования, как микромасштабный термофорез и просвечивающая электронная микроскопия. Были найдены мембрано-моделирующие системы, новые для GPCR и более оптимальные в плане стабильности и применимости в таких структурных подходах, как криоэлектронная микроскопия.

Публикации

1. Лугинина А, Маслов И, Хорн П, Волков О, Хныкин А, Кузьмичев П, Шевцов М, Белоусов А, Капранов И, Дашевский Д, Корнилов Д, Бесценная Е, Хофкенс Дж, Хендрикс Дж, Генш Т, Черезов В, Иванович В , Мишин А, Борщевский В. Functional GPCR Expression in Eukaryotic LEXSY System Journal of Molecular Biology, номер 435, том 23, выпуск 168310, страницы 1-16 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.jmb.2023.168310

2. П.А. Хорн, А.П. Лугинина, В.А. Поспелов, Д.Е. Дашевский, А.Н. Хныкин, О.В. Моисеева, Н.А. Сафронова, А.С. Белоусов, А.В. Мишин, В.И. Борщевский Rational Design of Drugs Targeting G-Protein-Coupled Receptors: A Structural Biology Perspective Biochemistry (Moscow), ISSN 0006-2979, Vol. 89, No. 4, pp. 747-764 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.1134/S0006297924040138

3. - Тритоны помогли ученым в производстве белков для исследований naked-science.ru, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются важнейшими фармакологическими мишенями, ввиду их разнообразной роли в физиологических процессах в организме человека. Однако данные белки относятся к одним из самых сложных объектов для структурно-функциональных исследований из-за их низкой стабильности и амфифильной природы, что замедляет биомедицинские разработки, нацеленные на данный класс объектов. Исследование и оптимизация мембрано-моделирующих систем позволит более эффективно проводить, в частности, высокопроизводительный скрининг новых кандидатов в лекарства, а также структурные исследования GPCR методом криоэлектронной микроскопии. Оптимизация мембрано-моделирующих систем послужит подспорьем для поиска терапевтических антител методом фагового дисплея, а также поиска маркеров заболеваний, в которые вовлечены рецепторы.