КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-74-00027
НазваниеИсследование специфичности антирестрикционной активности белков семейства ArdB
РуководительКудрявцева Анна Александровна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2022 - 06.2024 |
Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словаРестрикция, горизонтальный перенос генов, антирестрикция, ArdB
Код ГРНТИ34.15.23
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Горизонтальный перенос генов в бактериях играет решающую роль в распространении антибиотикорезистентности среди бактериальных штаммов. В данном проекте предполагается исследовать специфичность механизма работы антрестриктаз ArdB семейства, с помощью которых мобильные генетические элементы (плазмиды и бактериофаги) реализуют горизонтальный перенос генов в бактериях. Антирестриктазы ArdB семейства блокируют работу эндонуклеаз рестрикции I типа, но не влияют на работу соответствующих метилаз. Таким образом создаются оптимальные условия в клетке для модификации новоприобретённой ДНК. В настоящее время механизм работы антирестриктазы ArdB до сих пор остается загадкой. В рамках данного проекта будет проведено исследование специфичности антирестрикционной активности белка ArdB(R64). Впервые будет получена структура ArdB(R64) и его мутантов, характеризующихся низкой антирестрикционной активностью. Будет впервые проверена антирестрикционная активность ArdB(R64) и его мутантных форм in vitro против ферментов рестрикции-модификации I типа IB, IC семейств. Кроме того, будет оценена эффективность антирестрикционного механизма ArdB (R64) in vivo против ферментов рестрикции-модификации I типа IA, IB, IC семейств, а также систем рестрикции-модификации грамположительных бактерий. Впервые планируется сравнить уровни экспрессии ArdB (R64), достаточные для ингибирования следующих эндонуклеаз рестрикции: EcoR124I (IC), EcoAI (IB) и EcoKI (IA), а также двух систем рестрикции-модификации Bacillus licheniformis. В результате будут получены данные об эффективности ингибирования рестриктаз I класса разных семейств. Будет оценена специфичность антирестрикционного механизма ArdB. Полученные данные приблизят нас к разгадке механизма действия антирестриктазы ArdB.
Ожидаемые результаты
В то время как механизм работы белка АrdA хорошо исследован и заключается в конкурентном ингибировании ферментов рестрикции-модификации, до настоящего времени, несмотря на известную структуру, механизм работы ArdB остаётся загадкой. В рамках предложенного проекта впервые будет получена структура ArdB(R64) и его мутантов, характеризующихся низкой антирестрикционной активностью. Будет впервые проверена антирестрикционная активность ArdB(R64) и его мутантных форм in vitro против ферментов рестрикции-модификации I типа IB, IC семейств. Кроме того, будет оценена эффективность антирестрикционного механизма ArdB (R64) in vivo против ферментов рестрикции-модификации I типа IA, IB, IC семейств, а также систем рестрикции-модификации грамположительных бактерий. Впервые планируется сравнить уровни экспрессии ArdB (R64), достаточные для ингибирования следующих эндонуклеаз рестрикции: EcoR124I (IC), EcoAI (IB) и EcoKI (IA), а также двух систем рестрикции-модификации Bacillus licheniformis. В результате будут получены данные об эффективности ингибирования рестриктаз I класса разных семейств. Будет оценена специфичность антирестрикционного механизма ArdB.
Кроме того будет впервые получена структура ArdB(64), а также структуры его мутантных форм, характеризующихся сниженной антирестрикционной активностью. В результате запланированных работ будут получены данные, которые, возможно, позволят сделать заключение о механизмах работы антирестриктазы ArdB.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. В результате выполнения работ первого года была проверена антирестрикционная активность белка ArdB(R64) против систем рестрикции-модификации I типа IA, IB, IC грамотрицательных бактерий. Изогенность использованных для оценки антирестрикционной активности ArdB штаммов позволила продемонстрировать практически равную для всех трем систем рестрикции-модификации эффективность ингибирования.
2. Был разработан протокол выделения и очистки белка ArdB(R64). В результате была впервые продемонстрирована антирестрикционная активность ArdB(R64) in vitro.
3. Были впервые заклонированы две системы рестрикции-модификации I типа из грамположительных бактерий Bacillus liheniformis. Была продемонстрирована их эндонуклеазная активность.
4. Была показана антирестрикционная активность белка ArdB(R64) против обеих систем рестрикции модификации из B. licheniformis. Белок ArdB проявил себя как универсальных агент против широкого спектра систем-рестрикции-модификации I типа.
5. Для выполнения работ второго года была разработана генетическая конструкция позволяющая осуществлять экспрессия белка ArdB(R64) в штамме Escherichia coli TG1, не содержащем гены систем рестрикции-модификации I типа.
Публикации: 10.31857/S0026898423010056 ; 10.3389/fmicb.2023.1133144 ; 10.1007/s00253-022-12341-y
Публикации
1. Баженов С.В., Щеглова Е.С., Уткина А.А., Кудрявцева А.А., Ибрагим Р. А., Манухов И.В, New temperature‑switchable acyl homoserine lactone‑regulated expression vector Applied Microbiology and Biotechnology, 107 (807-818) (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s00253-022-12341-y
2. Кудрявцева А.А., Цсефалвай Е., Гнучих Е.Ю., Яновская Д.Д., Скутель М.А., Исаев А.Б., Баженов С.В., Уткина А.А., Манухов И.В. Broadness and specificity: ArdB, ArdA, and Ocr against various restriction-modification systems Frontiers in Microbiology, 14 - 2023 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1133144
3. Кудрявцеваa А.А., Алехин В.А., Лебедева М.Д., Csefalvay Е., Weiserova M., Манухов И.В. АКТИВНОСТЬ АНТИРЕСТРИКЦИОННОГО БЕЛКА ArdB В ОТНОШЕНИИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ EcoAⅠ Молекулярная биология, - (год публикации - 2023)