КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-00036

НазваниеКлеточные иммунные реакции гастропод на трематодную инвазию

РуководительТокмакова Арина Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный педагогический университет им. А. И. Герцена", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2022 - 06.2024 

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-109 - Паразитология

Ключевые словаБрюхоногие моллюски, иммунные реакции, гемопоэз, гемопоэтические стволовые клетки, гемоциты, экспрессия генов факторов иммунного ответа, инкапсуляция, трематоды, шистосомоз.

Код ГРНТИ34.23.31, 34.43.15

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Моллюски наряду с членистоногими обладают наиболее развитой среди беспозвоночных системой иммунитета, поэтому знания об их защитных реакциях важны для развития сравнительной иммунологии. Среди моллюсков особое внимание уделяется защитным реакциям брюхоногих моллюсков. В ведущих научных центрах активно изучаются различные аспекты клеточных и гуморальных иммунных реакций гастропод, в частности пульмонат, что в значительной степени обусловлено их ролью промежуточных хозяев в жизненных циклах трематод, многие из которых являются опасными паразитами человека и экономически важных животных. Среди них стоит отметить представителей семейства Schistosomatidae, многие представители которого в странах Африки, Азии и Южной Америки известны как опаснейшие паразиты человека. Однако с 2014 года было зарегистрировано несколько случаев заболевания на острове Корсика (Holtfreter et al., 2014; Boissier et al., 2016; Rothe et al., 2021). Установить вид паразита пока не удается, так как, возможно, он является гибридной формой (скорее Schistosoma haematobium). Этот факт еще раз показывает, что в условиях глобальных перемен в демографии и миграционной политики возможны неожиданные изменения в локализации очагов опасных гельминтозов, а также подтверждает актуальность организации мониторинга за их распространением. При этом основная информация о природе и механизмах защитных реакций брюхоногих моллюсков основана на сведениях, полученных при изучении лабораторных линий нескольких видов. В рамках Проекта планируется впервые выполнить комплексный анализ иммунных реакций пресноводных и наземных гастропод. Будут изучены гемопоэтические структуры моллюсков, механизм пролиферации недифференцированных клеток, дифференцировка прогемоцитов в гемоциты и функциональная морфология последних. Отдельное внимание планируется уделить функциональной активности гемоцитов и их роли в иммунном ответе. Кроме этого, будут изучены механизмы клеточных реакций на различные чужеродные факторы, включая трематодную инвазию. При этом особое внимание планируется уделить анализу специфичности иммунных реакций моллюсков при иммунизации трематодами и другими чужеродными факторами (введение ксенотрансплантатов, бактерий, чужеродных белков). На основании уже выполненного полного анализа транскриптомов гемоцитов Planorbarius corneus будут выбраны гены, для которых будет осуществлен анализ дифференциальной экспрессии при иммунизации различными факторами, с учётом её динамики. Большое внимание планируется уделить наличию нуклеотидных последовательностей, кодирующих лектины, а особенно – фибриноген-подобные белки. Именно эти молекулы, содержащие домены иммуноглобулинового суперсемейства, рассматриваются в качестве основного доказательства наличия специфических иммунных реакций у беспозвоночных. В работе будут использованы моллюски из природных популяций – Planorbarius corneus, Succinea putris, Lymnaea stagnalis, Helix pomatia, Viviparus viviparus, Bythinia tentaculata и моллюски лабораторных линий Biomphalaria glabrata. В работе будут использованы методы классической зоологии, паразитологии, гистохимии и иммуногистохимии, а также методы молекулярной биологии и биоинформатики. Планируемые результаты характеризуются новизной и будут иметь не только фундаментальное, но и практическое значение. Актуальность знаний об иммунной системе брюхоногих моллюсков обусловлена их большим экономическим значением для пищевой, фармакологической и косметической промышленности. Кроме того, внедрение в практику методов диагностики и профилактики трематодозов на основе высокотехнологичных методов перспективно для перенесения мер борьбы с ними на внутримоллюсковую стадию развития паразита, на которых не затрагивается организм человека и домашних животных. В частности, для ранней диагностики зараженности улиток партенитами трематод планируется разработать метод с использованием цитометрии, основанный на изменении состава циркулирующих клеток гемолимфы моллюсков в процессе заражения. Планируемые результаты характеризуются новизной и будут иметь не только фундаментальное, но и практическое значение.

Ожидаемые результаты
В рамках Проекта планируется решить вопрос о функциональной активности гемоцитов, участвующих в подавлении чужеродных факторов, охарактеризовать основные формы иммунного ответа брюхоногих моллюсков на патогены различной природы. Среди последних наиболее значимыми являются трематоды. Изучение защитных реакций гастропод на развитие партенит трематод, а также анализ специфичности иммунитета к инвазии будет способствовать раскрытию механизмов устойчивости паразито-хозяинной системы «трематоды-моллюски» и пониманию природы резистентности моллюсков. 1. Изучение гемопоэза и клеток гемолимфы с применением методов световой, конфокальной и электронной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, иммуноцитохимии позволит выполнить классификацию гемоцитов моллюсков разных видов. Впервые планируется установить клеточные маркеры, специфичные для разных стадий дифференцировки гемоцитов и их функционального состояния. Эти данные позволят описать центры гемопоэза моллюсков (их локализацию, структуру, динамику работы) и выявить стволовые гемопоэтические клетки. Также будет определен механизм мультипликации прогемоцитов и процесс их дифференцировки в разные типы гемоцитов. С использованием проточной цитометрии и стандартных иммуноцитохимических методов будет изучена функциональная активность клеток гемолимфы. Будет проведен анализ фагоцитарной, респираторной активности гемоцитов, их антигенной специфичности. Полученные результаты позволят объективно оценить участие гемоцитов в клеточном ответе моллюсков на иммунизацию различными патогенами. Полученные результаты внесут вклад в развитие теории врожденного иммунитета беспозвоночных животных. Разработанные подходы анализа популяционного состава гемоцитов моллюсков будут стандартизированы для выработки единого алгоритма проведения анализа гемолимфы моллюсков других видов. 2. В процессе иммунизации моллюсков различными чужеродными факторами (введение ксенотрансплантатов, бактерий, чужеродных белков, а также паразитарные инвазии) будут раскрыты механизмы их клеточных защитных реакций. Кроме того, полученные данные о защитных реакциях моллюсков на патогены различной природы смогут ускорить решение вопроса о специфичности клеточного иммунного ответа высших беспозвоночных животных. Проведенный анализ специфичности иммунных реакций моллюсков позволит раскрыть пути формирования этапов врожденного иммунитета моллюсков. Будет выявлена функциональная активность различных типов гемоцитов во время иммунного ответа и описана динамика основных форм защитных реакций моллюсков. Будет выполнен сравнительный анализ механизмов иммунных реакций гастропод разных видов. Полученные результаты важны для понимания становления и эволюции врожденного иммунитета животных в целом. 3. Впервые будет выполнен анализ дифференциальной экспрессии генов у природнозараженных и иммунизированных моллюсков Planorbarius corneus. На основании уже выполненного полного анализа транскриптомов гемоцитов P. corneus будут выбраны гены, для которых будет осуществлен анализ дифференциальной экспрессии при иммунизации различными факторами, с учётом её динамики. Большое внимание планируется уделить наличию нуклеотидных последовательностей, кодирующих лектины, а особенно – фибриноген-подобные белки. Именно эти молекулы, содержащие домены иммуноглобулинового суперсемейства, рассматриваются в качестве основного доказательства наличия специфических иммунных реакций у беспозвоночных. При исследовании природнозараженных моллюсков далеко не всегда удается точно определить срок заражения и соответственно проследить точную динамику защитных реакций. Поэтому дополнительно будет выполнена серия экспериментов по экспериментальной иммунизации моллюсков различными патогенами с последующим анализом экспрессии генов иммунного ответа. Особое внимание будет уделено транскриптам генов провоспалительных цитокинов, дифференцировочных факторов, циклинов и циклинзависимых киназ, компонентов системы комплемента.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект посвящен изучению клеточных иммунных реакций гастропод на трематодную инвазию. В ходе первого года выполнения Проекта была изучена морфология циркулирующих клеток гемолимфы лёгочных моллюсков Biomphalaria glabrata, Lymnaea stagnalis, Planorbarius corneus, Planorbis planorbis, Succinea putris и прозобранхий Viviparus viviparus. Результаты, полученные с использованием проточной цитофлуориметрии и микроскопии, подтвердили наличие в гемолимфе пульмонат двух основных типов клеток – гранулоцитов и гиалиноцитов, а у прозобранхий – трех типов. В свою очередь при анализе функциональной активности циркулирующих клеток гемолимфы каждая из основных популяций может разделяться на несколько субпопуляций. Для изученных гастропод установлено влияние на соотношение клеточных субпопуляций трематодной инвазии. Результаты цитофлуориметрического анализа гемолимфы пульмонат с применением специфических флуоресцентных красителей позволяют предположить у них наличие одной линии дифференцировки клеток. При этом разные типы гемоцитов формируются в результате последовательной дифференцировки клеток, образованных из прогемоцитов. В результате изучения гемопоэтических структур пульмонат модельных видов установлено, что у изученных моллюсков центром гемопоэза является амёбоцито-продуцирующий орган, морфологически приуроченный к перикардиальному эпителию. Здесь происходит мультипликация прогемоцитов, часть которых дифференцируется в гемоциты, выходящие в кровоток. Полученные результаты исследования клеточных защитных реакций пульмонат в целом подтверждают сходный характер протекания иммунного ответа на иммунизацию различными факторами, в том числе на трематодную инвазию. Эти реакции в основном носят универсальный характер и происходят в два этапа: первичная реакция в месте пенетрации патогена направлена на его изоляцию за счет гемоцитов из близлежащих тканей, во вторичной клеточной реакции задействованы гемоциты образованные после активации гемопоэза. Описаны основные формы реализации вторичной клеточной реакции – образование капсул, гемоцитарной сети и мантии вокруг партенит и метацеркарий трематод. Выполнен транскриптомный анализ гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus, интактных и зараженных трематодами Bilharziella polonica. В транскриптомах были обнаружены транскрипты, кодирующие все основные группы иммунных факторов, ранее описанные для других брюхоногих моллюсков. Наиболее разнообразной группой иммунных факторов являются молекулы распознавания патогенов. В частности, выявлены транскрипты, кодирующие многочисленные патогенраспознающие рецепторы (толл-подобные рецепторы, лектины, иммуноглобулиноподобные белки и др.), молекулы адгезии. Сравнение транскриптомов зараженных и интактных моллюсков показало, что при заражении экспрессия некоторых генов изменяется. Гемоциты зараженных моллюсков имеют большую репликационную, транскрипционную и трансляционную активность, а также более интенсивный энергетический метаболизм. Полученные данные подтверждают роль гемоцитов как основных эффекторных элементов иммунного ответа моллюсков и универсальность набора используемых иммунной системой гастропод факторов иммунитета. Также полученные результаты расширяют представление о механизмах иммунных реакций гастропод на трематодную инвазию и могут быть использованы для дальнейшего анализа дифференциальной экспрессии факторов иммунитета с помощью ПЦР со специфическим праймерами.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе второго года выполнения Проекта проведен анализ клеточного состава гемолимфы модельных видов легочных и переднежаберных моллюсков с использованием световой, конфокальной, электронной микроскопии, а также методов проточной цитофлуориметрии. Применение комплексного подхода позволило подтвердить разделение циркулирующих клеток гемолимфы на два основных типа – гранулоциты и гиалиноциты. Однако, гемоциты изученных видов прозобранхий наряду с основными имеют переходные формы клеток. В гранулоцитах и гиалиноцитах хорошо развит актиновый цитоскелет, ответственный за различия в форме клеток. Микротрубочки, выявляемые специфическими антителами к тубулину, образуют сеть, особенно развитую в гранулоцитах. Для обоих типов клеток характерно участие в клеточных защитных реакциях, включая фагоцитоз, инкапсуляцию, образование агглютинаций и гемоцитарной мантии. Выявлено влияние трематодной инвазии на изменение клеточного состава гемолимфы моллюсков. Во всех случаях соотношение типов клеток у заражённых моллюсков отличается от интактных. Полученные данные подтверждают существование одной линии дифференцировки клеток гемолимфы. Гемопоэтические стволовые клетки способны делится, обеспечивая мультипликацию прогемоцитов. Последние дифференцируются в гиалиноциты, а те – в гранулоциты. Во фракциях цитоплазматических мембран и цитоплазмы клеток мантии обнаружено наибольшее количество активной фенолоксидазы. Небольшая активность наблюдалась в цитоплазматической фракции головы, и во фракции цитоплазматических мембран гонады и гепатопанкреаса. Основным источником гемопоэза изученных лёгочных моллюсков является амёбоцито-продуцирующий орган, топографически приуроченный к перикардиальному эпителию. Выявлена пролиферативная активность в узелках, составляющих основу органа, которая повышается при иммунизации. При этом в специфичных паразито-хозяинных системах (вероятно, сформировавшихся в ходе длительной коэволюции) клеточные реакции могут быть выражены в меньшей степени или отсутствовать. В частности, при изучении клеточных реакций паразито-хозяинных моделей, в которых в качестве хозяина выступают представители лимнеид, лишь в некоторых случаях удалось обнаружить небольшие скопления или единичные гемоциты на поверхности партенит. С целью анализа пролиферативной активности клеток гемолимфы пульмонат проведено микроскопическое и цитометрическое изучение гемоцитов с использованием EdU. В результате среди циркулирующих гемоцитов удалось обнаружить EdU-положительные клетки. Однако, анализ клеточного цикла гемоцитов не показал увеличение количества ДНК в этих клетках. В ходе проведенного транскриптомного анализа было установлено, что у моллюсков Succinea putris присутствуют транскрипты всех основных групп факторов врождённого иммунитета, описанных ранее у животных других таксонов.

 

Публикации

1. Серебрякова М. К., Сахабеев Р. Г., Токмакова А. С. Клеточный состав гемолимфы моллюсков Viviparus viviparus (Gastropoda: Prosobranchia) Амурский зоологический журнал, т. XVI, № 2 (год публикации - 2024) https://doi.org/10.33910/2686-9519-2024-16-2-284-293

2. Усманова Р. Р., Токмакова А. С., Прохорова Е. Е., Корниенко А. А., Пчеленок Е. А., Атаев Г Л. Паразитофауна моллюсков Succinea putris Паразитология, - (год публикации - 2024)

3. Комиссаров А. А., Токмакова А. С. Клеточные реакции моллюсков на трематодную инвазию VII Съезд Паразитологического общества: итоги и актуальные задачи, VII съезд Паразитологического общества: итоги и актуальные задачи, 16–20 октября 2023 г., Петрозаводск, Россия : тезисы докладов : научное электронное издание / С. 154-155. (год публикации - 2023)

4. Серебрякова М. К., Токмакова А. С. Влияние трематодной инвазии на клеточный состав гемолимфы Planorbarius corneus VII Съезд Паразитологического общества: итоги и актуальные задачи, VII съезд Паразитологического общества: итоги и актуальные задачи, 16–20 октября 2023 г., Петрозаводск, Россия : тезисы докладов : научное электронное издание / С. 321-322. (год публикации - 2023)

Возможность практического использования результатов
не указано