Аннотация результатов, полученных в 2022 году
АТФ-синтаза является важнейшим белковым комплексом, обеспечивающим жизнедеятельность клеток, а производство аденозин трифосфата (АТФ) поддерживает большинство биохимических реакций в живых организмах. Эффективность синтеза АТФ (количество затраченных протонов на синтез одной молекулы АТФ) является основным параметром, определяющим биоэнергетику клеток. Влияние на эффективность синтеза АТФ оказывают такие факторы как олигомерное состояние АТФ-синтазы, а также возможное наличие низкомолекулярных лигандов, что было показано в наших предыдущих работах (Vlasov et al. 2019, DOI: 10.1038/s41598-019-55092-z; Vlasov et al. 2022, DOI: 10.1007/s00018-022-04153-0). В ходе работы был оптимизирован протокол выделения АТФ-синтазы из хлоропластов шпината и исследованы образцы АТФ-синтазы с различными лигандами. Методом электронной микроскопии была подтверждена целостность белкового комплекса, а структурные исследования АТФ-синтазы методом малоуглового рентгеновского рассеяния показали, что при определенных условиях (увеличение ионной силы) этот комплекс формирует димеры в форме буквы “I”, так что мембранные части (с-ринги) двух мономеров находятся по разные стороны димера, чего не было показано в литературе. Ранее, факт димеризации АТФ-синтаз из хлоропластов был показан для зеленых водорослей, но не было никаких структурных данных для обнаруженных димеров. Также в литературе были показаны неспецифические димеры и олигомеры хлоропластных АТФ-синтаз, однако у них мономеры располагаются параллельно рядом друг с другом и с-ринги встроены в одну часть мембраны. В нашей работе получены(Osipov et al. 2023 doi.org/10.20944/preprints202305.0170.v1) структурные данные методом МУРР, характеризующие новый тип димеризации хлоропластных АТФ-синтаз (в форме буквы “I”). На основе структурных данных построены модели, которые показывают, что контакт между мономерами АТФ-синтаз осуществляется через субъединицу δ, находящуюся на вершине каталитической головы ферментативного комплекса. Для подтверждения данной гипотезы был проведен макромолекулярный докинг, который показал, что помимо контакта между субъединицами δ, также возможны контакты между другими субъединицами, а именно α, β, b и b’. Было высказано предположение, что образование димеров АТФ-синтаз в форме буквы “I” может стабилизировать стопки тилакоидов путем возможного соединения соседних ламелл, характерное расстояние между которыми соответствует расстоянию между с-рингами двух мономеров АТФ-синтаз. Таким образом, мы предполагаем, что обнаруженный тип димеризации может быть новым механизмом тонкой регуляции синтеза АТФ в хлоропластах растений и предотвращения гидролиза АТФ в ночной период. Это согласуется с известным из литературы наблюдением увеличения ионной силы в хлоропластах растений в тёмное время суток. В работе был оптимизирован протокол встраивания АТФ-синтаз из хлоропластов шпината в липосомы, и налажено проведение функциональных тестов in vitro. Было подтверждено, что исследуемый структурными методами комплекс АТФ-синтазы из хлоропластов шпината является функциональным и синтезирует АТФ. Также были налажены функциональные тесты АТФ-синтазы из Escherichia coli в системах in vivo, для проведения которых были приготовлены суббактериальные частицы из Escherichia coli. В обоих экспериментах для определения количества АТФ использовался люциферин-люциферазный набор и люминометр для детекции люминесценции. Было проверено влияние еще одного лиганда на основе пластохинона на термостабильность АТФ-синтазы. Исследование проводилось с помощью красителя СРМ. Было показано, что добавление к АТФ-синтазе лиганда в той же или меньшей молярной концентрации, что и сам белковый комплекс, не влияет на термостабильность комплекса. Добавление же лиганда в концентрациях, на порядок или больше превышающих концентрацию АТФ-синтазы, увеличивает термостабильность комплекса, однако, возможно, влияет на его целостность. Это требует дополнительных структурных исследований комплекса АТФ-синтазы с лигандом. По результатам работы была подготовлена публикация "Evidence for the I-Shaped Dimers of a Plant Chloroplast FOF1-ATP Synthase in Response to Changes in Ionic Strength" и подана в журнал International Journal of Molecular Sciences, IF = 6.208, Q1. Опубликован препринт - (Osipov et al. 2023 doi.org/10.20944/preprints202305.0170.v1). Сейчас публикация находится на стадии рецензирования.