КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-74-00066

НазваниеВлияние субингибирующих концентраций антибиотиков на развитие лекарственной устойчивости у микобактерий

РуководительВатлин Алексей Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2022 - 06.2024

Конкурс№70 - Конкурс 2022 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаАнтимикробные агенты, природная лекарственная устойчивость, микобактерии, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis

Код ГРНТИ76.29.50

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Согласно данным ВОЗ, проблема устойчивости к антибиотикам является одной из наиболее серьезных угроз для здоровья человечества, продовольственной безопасности и развития. Устойчивость к антибиотикам -- естественное явление, однако неправильное использование антибиотиков людьми и их неправильное введение животным ускоряет этот процесс. Все больше инфекционных заболеваний – например пневмонию, туберкулез, гонорею и сальмонеллез – становится труднее лечить из-за снижения эффективности антибиотиков [WHO. Antibiotic resistance 2020]. Как известно, каждый третий житель земли является носителем возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis, из которых около 10 миллионов заболевают активной формой ежегодно. Особо остро стоит проблема развития лекарственной устойчивости, увеличением доли штаммов с МЛУ и ШЛУ (множественной и широкой лекарственной устойчивостью) фенотипом [WHO. Global tuberculosis report 2019]. В последнее время в литературе появляется все больше сообщений о наличии субингибирующих концентраций антибиотиков, которые ускоряют возникновение устойчивости у бактериальных штаммов и при этом на порядки меньше стандартных известных минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Было показано, что концентрации антибиотиков, обнаруженные в природе, влияют на ускорение возникновение устойчивости в бактериальных консорциумах и представляют серьезную угрозу для медицины. По результатам данных работ в 2015 году Европейская комиссия отобрала ряд антибиотиков (EuropeanCommission, Watch List, 2015), применение которых требует особого внимание. В этот список попал ряд макролидных антибиотиков (азитромицин, кларитромицин и эритромицин), а в 2018 году его дополнили антибиотиками ципрофлоксацином и амоксициллином. Сегодня мировое научное сообщество ставит проблему «загрязнения» антибиотиками окружающей среды (в том числе при пищевом производстве) как одну из наибольших опасностей для возникновения лекарственной устойчивости. Так, согласно документам, регламентирующим минимальные допустимые концентрации антимикробных агентов в продуктах питания в США, ЕС и Таможенном союзе, допускается присутствие в продуктах антибиотиков: канамицина, тетрациклина, офлоксацина, ципрофлоксацина в концентрациях до 2,5 мг/кг. Помимо антибиотиков, попадающих в организм с пищей, широко распространен неконтролируемый прием антибиотиков населением, без назначения врача. Предлагаемый проект направлен на исследование влияния индукции низкими дозами антибиотиков, в том числе присутствующих в продуктах питания, на развитие приобретенной лекарственной устойчивости у микобактерий. Впервые будет проведено исследование влияния субингибирующих концентраций различных антибиотиков на частоту возникновения спонтанных мутаций, приводящих к резистентному фенотипу микобактерий, а также исследованы генетические механизмы, приводящие к сверхустойчивому фенотипу на фоне индукции субингибирующими концентрациями антибиотиков. Результаты работы позволят выяснить насколько критичны субингибирующие концентрации антибиотиков, применяемых при пищевом производстве (стрептомицин, канамицин, офлоксацин и тетрациклин), для развития перекрестной лекарственной устойчивости у микобактерий к антибиотикам, используемым при лечении туберкулеза (канамицин, рифампицин, ципрофлоксацин и бедаквилин), а также установить взаимосвязь между наличием индукции и частотой возникновения устойчивых мутантных штаммов микобактерий.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения данного проекта планируется установить механизмы возникновения лекарственной устойчивости микобактерий при индукции субингибирующими концентрациями антибиотиков, активно применяемых в сельском хозяйстве. Будет установлена роль субингибирующих концентраций индукторов (стрептомицин, канамицин, офлоксацин и тетрациклин) на частоту возникновения мутантных штаммов к антибиотикам, которые используются при лечении туберкулеза (канамицин, рифампицин, ципрофлоксацин и бедаквилин). Будут получены сверхустойчивые (до 512хМИК) мутантные штаммы M. smegmatis mc2 155. Будет проведено полногеномное секвенирование полученных устойчивых штаммов для установления механизма устойчивости и доказано с помощью методов обратной генетики участие выявленных мутаций в формировании фенотипа устойчивости. Мы ожидаем обнаружить ранее неизвестные механизмы устойчивости микобактерий к антибиотикам, активно применяемым в терапевтических целях.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно данным ВОЗ, проблема устойчивости к антибиотикам является одной из наиболее серьезных угроз для здоровья человечества, продовольственной безопасности и развития. Устойчивость к антибиотикам -- естественное явление, однако неправильное использование антибиотиков людьми и их неправильное введение животным ускоряет этот процесс. Туберкулез входит в топ-10 причин смерти во всем мире, а возбудитель этого заболевания — микроорганизм Mycobacterium tuberculosis — обнаруживается примерно у четверти населения земного шара, хотя и в «спящей форме». Особо остро стоит проблема развития лекарственной устойчивости, увеличением доли штаммов с МЛУ и ШЛУ (множественной и широкой лекарственной устойчивостью) фенотипом [WHO. Global tuberculosis report 2019]. В последнее время в литературе появляется все больше сообщений о наличии субингибирующих концентраций антибиотиков, которые ускоряют возникновение устойчивости у бактериальных штаммов и при этом на порядки меньше стандартных известных минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Сегодня мировое научное сообщество ставит проблему «загрязнения» антибиотиками окружающей среды (в том числе при пищевом производстве) как одну из наибольших опасностей для возникновения лекарственной устойчивости. Так, согласно документам, регламентирующим минимальные допустимые концентрации антимикробных агентов в продуктах питания в США, ЕС и Таможенном союзе, допускается присутствие в продуктах антибиотиков: канамицина, тетрациклина, офлоксацина, ципрофлоксацина в концентрациях до 2,5 мг/кг. В результате выполнения первого года проекта нами было показано, что микроконцентрации антибиотиков, сопоставимые с разрешенными при пищевом производстве концентрациями, могут вызывать индукцию устойчивости у микобактериальных штаммов генов природного резистома. Нами было показано, что концентрации, не влияющие на рост, вызывают повышение устойчивости к целому ряду антибиотиков, а также изменяют экспрессию целого ряда глобальных регуляторов, которые по литературным данным вовлечены в формирование устойчивости к большинству применяемых на сегодня антибиотиков. Дополнительно мы показали, что индукция микроконцентрациями антибиотиков (стрептомицин, канамицин, офлоксацин и тетрациклин) штамма микобактерий M. smegmatis, который является модельным при изучении механизмов устойчивости у микобактерий, может приводить к увеличению частоты возникновения мутантных штаммов. Наша работа позволит доказать, что повсеместное применение антибиотиков и их накопление в окружающей среде (в результате применения в пищевой промышленности и медицине) может приводить к индукции природных механизмов устойчивости у микобактерий.

Публикации

1. Ватлин А.А., Беккер О.Б., Шур К.В., Ильясов Р.А., Шатров П.А., Маслов Д.А., Даниленко В.Н.. Kanamycin and Ofloxacin Activate the Intrinsic Resistance to Multiple Antibiotics in Mycobacterium smegmatis Biology, 2023, 12, 506. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biology12040506

2. - Малые дозы антибиотиков превратили возбудителя туберкулеза в суперпатоген без изменения его ДНК Пресс-служба РНФ, - (год публикации - )

3. - Раскрыт новый вариант превращения микробов в "супербактерий" Тасс-Наука, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проблема антибиотикорезистентности, отмеченная ВОЗ, связана с распространением бактерий и генов антибиотикорезистентности между людьми, животными и окружающей средой, а также с накоплением антибиотиков в окружающей среде. Недавние исследования показывают, что даже концентрации антибиотиков, значительно ниже минимальных ингибирующих концентраций (МИК), называемые минимальными селективными концентрациями (МСК), могут приводить к изменениям в резистентности бактерий и индукции устойчивости к лекарствам. Это может происходить даже при концентрациях антибиотиков в окружающей среде, превышающих МСК в несколько раз. В результате выполнения второго года проекта по теме «Влияние субингибирующих концентраций антибиотиков на развитие лекарственной устойчивости у микобактерий» был проведен окончательный геномный анализ мутантных штаммов M. smegmatis, устойчивых к различным антибиотикам, которые были получены при индукции концентрациями антибиотиков не влияющих на рост. В результате полногеномного секвенирования и последующего биоинформатического анализа впервые показано, что индукция природной лекарственной устойчивости у штаммов, индуцированных тетрациклином и офлоксацином и устойчивых к рифампицину приводит к возникновению общей мутации (MSMEG_RS00090, 9437A>C, non-ribosomal peptide synthetase), но при этом эти штаммы имели и другие мутации, а именно в гене rpoB, мутации в котором являются маркером устойчивости к рифампицину, а также между генами MSMEG_RS16820 и MSMEG_RS16815 (katG). katG также является одним из маркеров устойчивости к рифампицину у микобактерий. В штамме устойчивому к ципрофлоксацину удалось обнаружить мутации в генах sufB (MSMEG_RS15160, 919G>C), aldehyde dehydrogenase (adh, MSMEG_RS07540, 505A>C) и ABC transporter (MSMEG_RS22010, 502C>A). Дополнительно мы изучили, как тетрациклин, офлоксацин и канамицин, применяемые в концентрациях, которые не влияют на рост клеток, могут увеличить устойчивость Mycobacterium smegmatis mc2 155 к бедаквилину. Мы обнаружили, что тетрациклин увеличивает устойчивость культуры микобактерий к бедаквилину. Наш анализ показал, что это происходит за счет увеличения экспрессии гена, который активирует активный эффлюкс бедаквилина из клетки. Дополнительные исследования подтвердили, что скорость роста M. smegmatis mc2 155 меняется при индукции устойчивости природного резистома низкими концентрациями тетрациклина в присутствии бедаквилина, что подтверждает возможность выбора штаммов с усиленной устойчивостью из-за разницы в скорости их роста.

Публикации

1. Ватлин А.А., Цыбизов Д.А., Летвинова В.С., Даниленко В.Н. Тетрациклиновая индукция природной лекарственной устойчивости к бедаквилину у Mycobacterium smegmatis mc2 155 Генетика, - (год публикации - 2024)

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта позволяют более направленно подходить к использованию антибиотиков в современной медицине, а также в пищевой и сельскохозяйственной промышленности, так как было показано, что даже маленькие концентрации антибиотиков могут вызывать активацию генов природного резистома.